Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

Riepilogo

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Abstract

La barriera epiteliale è la prima difesa innata del tratto gastrointestinale e regola selettivamente trasporto dal lume ai compartimenti sottostanti, limitare il trasporto di molecole più piccole attraverso l'epitelio e quasi completamente vieta epiteliale trasporto macromolecolare. Questa selettività è determinata dallo strato di gel mucoso, che limita il trasporto di molecole lipofile ed entrambi i recettori apicali e stretti complessi proteici giunzionali dell'epitelio. Modelli in vitro su colture di cellule dell'epitelio sono convenienti, ma come un modello, non hanno la complessità delle interazioni tra microbiota, muco-gel, epitelio e il sistema immunitario. D'altra parte, la valutazione in vivo dell'assorbimento intestinale o permeabilità può essere eseguita, ma questi test misurare il grado di assorbimento gastrointestinale, senza alcuna indicazione di specificità del sito. Ex vivo saggi permeabilità utilizzando "sacche intestinali"; sono un metodo rapido e sensibile per misurare sia l'integrità intestinale globale o il trasporto comparativa di una molecola specifica, con l'ulteriore vantaggio di specificità del sito intestinale. Qui si descrive la preparazione di sacche intestinali per gli studi di permeabilità e il calcolo della permeabilità apparente (P _app) di una molecola attraverso la barriera intestinale. Questa tecnica può essere utilizzata come un metodo di valutazione assorbimento del farmaco, o per esaminare disfunzione barriera epiteliale regionale in modelli animali di malattia gastrointestinale.

Introduzione

La barriera epiteliale intestinale del tratto gastrointestinale è una superficie mucosa stimato a 400 m ² nel umano adulto. Di conseguenza, si è costantemente esposto a sfidare da microbi, farmaci ingeriti, nutrienti e tossine batteriche. L'host non solo deve distinguere tra batteri commensali tollerabili e potenziali patogeni, ma deve impedire queste specie e loro molecole secrete di attraversare la barriera epiteliale, mentre allo stesso tempo permette l'assorbimento dei nutrienti. Pertanto, il ruolo dell'epitelio intestinale è di agire come barriera selettiva al contenuto luminale ^1. Questo risultato è ottenuto, in parte, dal sistema di difesa epiteliale innato alla mucosa, che agisce attraverso un sistema biologico reattivo costituito da costitutive e inducibili meccanismi ^2.

La perdita della funzione barriera epiteliale è una patologia che è caratteristica di un certo numero di malattie gastrointestinali. In vivoesame della funzione di barriera epiteliale può essere valutata attraverso sonda gastrica di una molecola tracciante e la successiva analisi del siero ^3. Tuttavia, questa tecnica non offre alcuna indicazione sul sito di disfunzione barriera. In vitro e ex vivo valutazione della resistenza transepiteliale utilizzando sistemi Transwell ³ e ussing rispettivamente camere di ^4,5, sono comunemente impiegati come indicatori surrogati di funzione di barriera epiteliale, ma manca la contribuendo malattia fisiologia dei modelli animali ^6. In questo protocollo si descrive un modello di preparazione del tessuto ex vivo che permette una valutazione diretta e localizzata dell'integrità intestinale e che può essere utilizzato per valutare la funzione barriera della mucosa a diversi livelli. È importante sottolineare che questa tecnica può essere applicata a modelli animali di malattia, o può essere farmacologicamente manipolato per permettere a fondo interrogatori di disfunzione barriera mucosa.

Protocollo

Tutti i lavori degli animali in questo protocollo viene eseguita con la stretta aderenza alle Università di Newcastle comitato etico degli animali procedure approvate.

1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e Piatti

1. Pre-caldo media 199 (TC199) o Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supporti a 37 ° C. Pre-ossigenare il supporto facendo gorgogliare con il 95% O _2/5% di CO _2. Verificare che il mezzo ha un pH finale di 7,3.
2. Preparare sutura tagliando due sezioni 5 cm per ogni uscita. Loop i punti di sutura in un nodo non chiusa.

2. dissezione e preparazione del tratto gastrointestinale

1. Ritirare solido cibo 12 ore prima di eutanasia. Se lo si desidera, inserire gli animali sugli integratori gel nutrienti durante questo periodo.
2. Euthanize topi per overdose pentobarbitone sodio ([200 mg / Kg], iniezione intraperitoneale) seguita da dislocazione cervicale in conformità con l'etica proto istituzionaleCols e spruzzare il 70% di etanolo sul addome e torace.
3. Usando una forbice, fare una incisione orizzontale nel mezzo dell'addome ed esporre il peritoneo.
4. Procedere per separare e rimuovere il tratto gastrointestinale tagliando il piccolo intestino superiore dallo stomaco al sfintere piloro e taglio crasso al margine anale. Utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente il mesentere. Posizionare il tratto intestinale in pre-riscaldato, medio ossigenato.
5. Identificare la sezione dell'intestino da valutare per permeabilità (Figura 1) e tagliare questa sezione libera dal resto del tratto intestinale.
   1. Al fine di mantenere la coerenza tra animali, misurare le sezioni di duodeno e nel digiuno rispetto allo stomaco, e misurare le sezioni di colon e dell'ileo rispetto al cieco.
   2. Quando si seleziona segmenti di tessuto, notare la presenza di tessuti linfoidi mucosa-associati, come le placche di Peyer. Questi possono essere identificati come piccolo cenno del capoORME sul lato sierose del lume.
   3. Usando una siringa da 1 ml, lavare delicatamente il contenuto luminale del segmento intestinale in una capsula di Petri con PBS preriscaldato (37 ° C). Questi contenuti fecali possono essere scartati o conservati a -80 ° C per le analisi future, se lo desideri.

3. Preparazione intestinale Sacs

1. Preparare una siringa da 1 ml con un volume di 300 microlitri del composto di prova o molecola. Per l'integrità della mucosa, un 1 mg / ml soluzione di FITC-destrano M.Wt. 4.400 possono essere utilizzati. Le sonde che vanno da 4,400-70,000 Da dimensioni possono essere utilizzati per una maggiore sensibilità. Trovare e montare un piccolo catetere vascolare animali sulla siringa.
2. Misura 5 cm dall'apertura del segmento intestinale e legare il segmento completamente chiuse con una sutura-loop a questo punto. Posizionare delicatamente una sutura-loop pre-legata intorno all'apertura dell'intestino e inserire il catetere smussata. Tirare il cappio chiuso in modo da assicurare il segmento intestinalee rilasciare il volume 300 microlitri dalla siringa nell'intestino, assicurando che tutta la soluzione viene iniettata.
3. Rimuovere delicatamente il catetere e contemporaneamente tirare il cappio di sutura per fissare la chiusura del sacco intestinale. Tagliare il sacco intestinale sciolto dall'intestino e posto in un tubo da 50 ml riempito con 20 ml di terreno ossigenato, preriscaldata a 37 ° C.

4. la misura della permeabilità

1. Luogo provette coniche contenenti le sacche intestinali in un bagno d'acqua riscaldata impostati su 37 ° C. A 0, 30, 60, 90 e 120 punti min tempo, prelevare un campione di 100 microlitri dalla provetta conica e trasferimento ad una piastra da 96 pozzetti, sostituendo il volume con 100 ml di mezzi freschi in ciascun caso.
2. Dopo aver prelevato il campione finale, tagliare sacche aperte al punto di sutura e la lunghezza del segmento, esponendo la superficie mucosa.
3. Misurare la lunghezza e la larghezza di ogni segmento intestinale. Se Desirosso, scatto congelare i segmenti e conservare a -80 ° C per le proteine ​​o l'analisi biochimica, o, in alternativa, conservare in soluzione di stabilizzazione RNA per saggi molecolari.
4. Costruire una curva standard di diluizioni di registro per le molecole FITC-etichettati da 1 a 1 x ¹⁰ -6.
5. Misure di campioni e standard per FITC su un lettore di piastre a fluorescenza, FITC di eccitazione / emissione: 495 nm / 519 nm.

5. Calcolo di permeabilità apparente per ogni intestinale individuale Sac

1. Convertire unità di tempo di sec.
2. Per ogni punto di tempo, calcolare la concentrazione cumulativa, Q
   
   Q _t = (C _t * V _r) + (Q _{t somma} * V _s), dove:
   
   Q _t = concentrazione cumulativa al tempo t
   C _t = concentrazione al tempo t
   V _{r =} Volume sul lato ricevente
   Q _{t somma} = Somma di tutte le precedenti Q _t
   V _s =volume campionato
   
3. Trama Q in funzione del tempo (T) e calcolare la pendenza: AQ / DT
4. Calcolare la permeabilità apparente (P _app)
   
   P _{app =} (AQ / T) / (A * Co), dove:
   
   A = area di tessuto
   C ₀ = concentrazione iniziale

Risultati

Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti regionali in funzione di barriera intestinale in modelli animali di malattie gastrointestinali. Misurando il flusso di una sonda paracellular sulla superficie mucosa in diverse aree del tratto gastrointestinale ^7, l'integrità delle giunzioni strette epiteliali può essere valutata. Inoltre, variando la natura della sonda paracellular per dimensione (Figura 2) o idrofobicità (Fig...

Discussione

Qui, abbiamo descritto l'isolamento e la preparazione di sacche intestinali per valutare la funzione barriera della mucosa ex vivo. preparazioni sac intestinali sono principalmente utilizzati nella ricerca farmaceutica, esaminando l'assorbimento di farmaci candidati attraverso l'intestino. Tuttavia, questo test è ugualmente adatta per lo studio della malattia intestinale. La permeabilità intestinale può variare notevolmente da regione a regione e la valutazione specifica del sito di permeabilità...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dekantel  Non-absorbable Silk suture	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)	Life Technologies	11043-023	No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	21063-045	No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich		Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW	Sigma Aldrich	FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW	Sigma Aldrich	FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW	Sigma Aldrich	FD-70