倒胶体晶体聚（乙二醇）脚手架制作：肝脏组织工程三维细胞培养平台

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

维持肝细胞功能的体外，用于测试异生素“的细胞毒性，研究病毒感染和开发针对肝脏的药物为目的的能力，需要在哪些小区得到适当的生物化学和机械线索的平台。最近肝组织工程系统已采用合成的或天然的水凝胶组成的三维（3D）支架，由于其高保水性和其提供由该细胞所需要的机械性刺激的能力。出现了在倒胶态晶体（ICC）的脚手架越来越大的兴趣，最近的发展，其允许高空间组织，同型和异型细胞相互作用，以及细胞外基质（ECM）的相互作用。在此，我们描述了一个协议使用聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEGDA），颗粒沥滤方法来制造IC卡支架。简要地说，一个晶格是由微颗粒制成，在这之后的预聚合物：R染料溶液加入，适当地聚合，然后颗粒被除去，或者浸出，使用有机溶剂（ 如，四氢呋喃）。晶格结果与控制的孔尺寸和interconnectivities允许媒体更容易地达到电池的高度多孔支架的溶解。这种独特的结构允许所述细胞附着的能力来涂覆PEGDA IC卡支架与蛋白质还示出对电池性能有显着影响的孔之间以及容易的通信，和高的表面积。我们分析了支架的形态，以及肝癌细胞（的Huh-7.5）行为存活率方面和功能探索ICC结构和ECM涂料的效果。总体而言，本文提供了在组织工程中广泛应用，尤其是肝脏组织工程支架出现了详细的协议。

肝脏是一个高度血管器官与多种功能，包括血液解毒，异生素的代谢，以及生产的血清蛋白。肝组织具有复杂的三维（3D）微结构，其包含多种细胞类型，胆管，正弦，和不同的生物基质的组成和不同的氧浓度的区域。鉴于这种精细结构中，它已经难于创建体外 ¹适当肝模型。然而，对于在体外模型官能托管人肝细胞用于测试药物毒性²平台和学习与肝³相关联的疾病的需求上升。

当前肝组织工程平台已经通过分离，或者集中于几个，肝脏的参数，单元⁴即共培养，所述透明的生化组成简化了肝脏的复杂性升微环境^5，流动动力学^6,7和生物基质⁸的结构。在生物基质的结构可分为参数，如支架材料，细胞外基质（ECM）蛋白的组合物，基质硬度以及支架的设计和结构。已经有使用合成水凝胶，特别是聚（乙二醇）（PEG）水凝胶⁹的组织工程研究的上升，由于能够调整水凝胶的机械性能，生物活性，和降解速率。对于肝脏相关的研究，生物相容性水凝胶应用于肝病³的病毒感染研究。作为肝细胞平台设计，许多研究已经利用肝细胞三明治培养^10,11和电池封装的水凝胶^12,13内，以提供3D环境和细胞ECM和细胞-细胞相互作用这是必不可少的体内微环境模仿。豪版本，这些平台不具有高度....

1. ICC脚手架制作（图1）

1. 制备聚苯乙烯（PS）棱（直径= 6毫米;珠8-13层）。
   1. 为了准备模具，从0.2毫升煮沸型离心管切的提示关闭在40微升的水平。附着切割管的顶端与防水胶24×60毫米²显微镜盖玻璃滑动。
   2. 放包含在水悬浮液中进20ml小瓶在PS球（直径= 140微米），小心地吸取出来的水悬浮液，并加入18毫升70％的乙醇溶液到小瓶。把球体溶液放入超声波浴松开凝集球体。重?.......

对于IC卡支架的结构表征和各IC卡支架状态的功效的在培养的肝细胞比较代表结果示和说明。在这些结果中使用的IC卡的支架条件是0微克/毫升（裸），20微克/毫升（胶原20），200微克/毫升（胶原200），和400微克/毫升（胶原400）和初始胶原涂层咦-7.5细胞种植数量为1×10 ^6。

ICC孔互连和支架的拓扑结构表征。

组织工程支架的快速发展提供一切必要的再生，维持或器官替代的应用程序修复组织，研究疾病，药物开发的物理和生化线索，和许多其他^57。在肝组织工程，原代人肝细胞迅速失去其代谢功能，一旦从主体分离，从而为工程支架非常需要和显影平台维持肝功能。 体外肝细胞培养平台目前已经利用不同的生物材料。在这方面的研究已集中于模仿体内肝微环境的各种特征，如EC.......

笔者希望从国家研究基金会奖学金（NRF -NRFF2011-01）与竞争研究计划（NRF-CRP10-2012-07）承认支持。