Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.
, ์์ฒด ์ด๋ฌผ์ง '๋ ์ฑ ํ ์คํธ ๋ฐ์ด๋ฌ์ค ๊ฐ์ผ ์ฐ๊ตฌ ๋ฐ ๊ฐ์์ ๋์์ผ๋ก ์ฝ๋ฌผ์ ๊ฐ๋ฐํ๊ธฐ์ํ ๋ชฉ์ ์ผ๋ก, ์ํ ๊ด๋ด ๊ฐ์ธํฌ์ ๊ธฐ๋ฅ์ ์ ์งํ๋ ๋ฅ๋ ฅ์ ์ธํฌ ์ ๋นํ ์ํํ ์ ๋ฐ ๊ธฐ๊ณ์ ์ ํธ๋ฅผ ์์ ํ ํ๋ซํผ์ด ํ์ํ๋ค. ์ต๊ทผ ๊ฐ ์กฐ์ง ๊ณตํ ์์คํ ์ ๋์ ์๋ถ ๋ณด์ ํ๊ณ ์ธํฌ์ ํ์ํ ๊ธฐ๊ณ์ ์ธ ์๊ทน์ ์ ๊ณต ํ ๋ฅ๋ ฅ์ด ์ฃผ์ด ํฉ์ฑ ๋๋ ์ฒ์ฐ ํ์ด๋๋ก ๊ฒ๋ก ๊ตฌ์ฑ๋ 3 ์ฐจ์ ์ง์ง์ฒด๋ฅผ ์ด์ฉ ํ์๋ค. ๋ฐ์ ์ฝ๋ก์ด๋ ๊ฒฐ์ (ICC) ์ง์ง์ฒด์ ๋ํ ๊ด์ฌ์ด ์ฆ๊ฐ๋๊ณ ์๋ค, ๋์ ๊ณต๊ฐ ์กฐ์ง ๋ํ๊ณผ ์ดํ ์ธํฌ์ ์ํธ ์์ฉ๋ฟ๋ง ์๋๋ผ, ์ธํฌ ์ธ ๊ธฐ์ง (ECM)์ ์ํธ ์์ฉ์ ๊ฐ๋ฅํ๊ฒํ๋ ์ต๊ทผ์ ๊ฐ๋ฐ. ์ฌ๊ธฐ์, ์ฐ๋ฆฌ๋ ํด๋ฆฌ (์ํธ๋ ๊ธ๋ฆฌ์ฝ) ๋ ์ํฌ๋ฆด ๋ ์ดํธ (PEGDA) ๋ฐ ์ ์ ์นจ์ถ ๋ฐฉ๋ฒ์ ์ด์ฉํ์ฌ ICC ์ง์ง์ฒด๋ฅผ ์ ์กฐํ๋ ํ๋กํ ์ฝ์ ๊ธฐ์ ํ๋ค. ๊ฐ๋ตํ๊ฒ, ๊ฒฉ์๋ ๋ฏธ์ธ ์ ์๋ก๋ถํฐ ๋ง๋ค์ด์ง๋ ์ ํ polymeR ์ฉ์ก ์คํฉ ์ ์ ํ ์ฒจ๊ฐ๋๊ณ , ์ ์๋ ์ ๊ธฐ ์ฉ๋งค (์ : ํ ํธ๋ผ ํ๋๋ก ํธ๋)์ ์ฌ์ฉํ์ฌ ์ ๊ฑฐํ๊ฑฐ๋ ์นจ์ถ๋๋ค. ์ ์ด ๋ ๊ธฐ๊ณต ํฌ๊ธฐ ๋ฐ ๋ฏธ๋์ด๋ณด๋ค ์ฝ๊ฒโโ ์ธํฌ์ ๋๋ฌ ํ ์ ์๋๋ก ์ํธ ์ฐ๊ด์ฑ์ด์๋ ๋ค๊ณต์ฑ ์ง์ง์ฒด์ ๊ฒฉ์ ๊ฒฐ๊ณผ์ ์ฉํด. ์ด ๋ ํนํ ๊ตฌ์กฐ๋ ์ธํฌ๋ฟ๋ง ์๋๋ผ ์ฝ๊ฒ ๊ธฐ๊ณต ์ฌ์ด์ ํต์ , ๋ฐ ๋จ๋ฐฑ์ง๊ณผ PEGDA์ ICC ์ง์ง์ฒด๋ ์ ์ง ์ฑ๋ฅ์ ํ์ ํ ํจ๊ณผ๋ฅผ ๋ํ๋ธ๋ค ์ฝํ ํ ์์๋ ๋ฅ๋ ฅ์ ๋ถ์ฐฉํ๊ธฐ์ํ ๊ณ ํ๋ฉด์ ์ ํ์ฉํ๋ค. ์ฐ๋ฆฌ๋ ๊ฐ๋ฅ์ฑ์ ๊ด์ ์์, ๊ณจ๊ฒฉ์ ํํ๋ฟ๋ง ์๋๋ผ, ๊ฐ์ ์ธํฌ (ํ 7.5) ๋์์ ๋ถ์ํ๊ณ ICC ๊ตฌ์กฐ ECM ์ฝํ ์ ํจ๊ณผ๋ฅผ ์กฐ์ฌํ๋ ๊ธฐ๋ฅ์ํ๋ค. ์ ๋ฐ์ ์ผ๋ก,์ด ๋ ผ๋ฌธ์ ์กฐ์ง ๊ณตํ์์ ๋ค์ํ ์์ฉ ํ๋ก๊ทธ๋จ, ํนํ ๊ฐ ์กฐ์ง ๊ณตํ์ ๊ฐ์ง ์๋ก์ด ๋ฐํ์ ์์ธํ ํ๋กํ ์ฝ์ ์ ๊ณตํฉ๋๋ค.
๊ฐ์ ํ์ก ํด๋ , ์์ฒด ์ด๋ฌผ์ง์ ๋์ฌ ๋ฐ ํ์ฒญ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์์ฐ์ ํฌํจํ์ฌ ๋ค์ํ ๊ธฐ๋ฅ์ ๊ฐ์ง ๋งค์ฐ ํ๊ด ๊ธฐ๊ด์ด๋ค. ๊ฐ ์กฐ์ง์ ์ฌ๋ฌ ์ข ๋ฅ์ ์ธํฌ, ๋ด์ฆ ๋์๊ด, ์ ํํ ๋ฐ ๋ค๋ฅธ biomatrix ์กฐ์ฑ๋ฌผ ๋ฐ ๋ค๋ฅธ ์ฐ์ ๋๋์ ์์ญ์ผ๋ก ํฌํจํ๋ ๋ณต์กํ 3 ์ฐจ์ ๋ง์ดํฌ๋ก ๊ตฌ์กฐ๋ฅผ ๊ฐ๋๋ค. ์ด๋ฌํ ๋ณต์กํ ๊ตฌ์กฐ๋ฅผ ๊ณ ๋ คํ ๋ ์ํ ๊ด๋ด (1) ์ ์ ํ ๊ฐ ๋ชจ๋ธ์ ๋ง๋๋ ๊ฒ์ด ์ด๋ ค์ ๋ค. ๊ทธ๋ฌ๋, ์ํ ๊ด๋ด ๋ชจ๋ธ์์ ๊ธฐ๋ฅ ํ ์คํธ ์ฝ๋ฌผ ๋ ์ฑ 2 ํ๋ซํผ ์ธ๊ฐ ๊ฐ์ธํฌ๋ฅผ ํธ์คํ ๊ฐ 3๊ณผ ๊ด๋ จ๋ ์งํ์ ์ฐ๊ตฌํ๋ ์์๊ฐ์๋ค.
ํ์ฌ ๊ฐ์ ์กฐ์ง ๊ณตํ ํ๋ซํผ ์กฐ๋์ ์ํํ ์ ์กฐ์ฑ๋ฌผ์ ๋ถ๋ฆฌ, ๋๋ ๊ฐ์ฅ์ ํ๋ผ๋ฏธํฐ ์ค, ๋ช ๊ฐ์ ์ (4) ์ฆ, ๊ณต์กด ๋ฐฐ์์ ์ง์คํ์ฌ ๊ฐ์์ ๋ณต์ก์ฑ์ ๋จ์ํ ํL ๊ฐ์ ๋ฏธ์ธ ํ๊ฒฝ 5 ์ ๋ ์ญํ 6,7 ๋ฐ biomatrix 8์ ๊ตฌ์ฑ. biomatrix ๊ตฌ์ฑ์ ์ง์ง์ฒด ๋ฌผ์ง, ์ธํฌ ์ธ ๊ธฐ์ง (ECM) ๋จ๋ฐฑ์ง ์กฐ์ฑ๋ฌผ, ๋งคํธ๋ฆญ์ค ๊ฒฝ๋๋ฟ๋ง ์๋๋ผ ์ง์ง์ฒด์ ๋์์ธ ๋ฐ ๊ตฌ์กฐ์ ๊ฐ์ ํ๋ผ๋ฏธํฐ๋ก ๋๋ ์์๋ค. ์กฐ์ ํ์ด๋๋ก ๊ฒ์ ๊ธฐ๊ณ์ ํน์ฑ, ์์ฒด ํ์ฑ ๋ฐ ์ดํ ์จ์ ๊ธฐ๋ฅ ๋ถ์ฌ, ํฉ์ฑ ํ์ด๋๋ก ๊ฒ....
1. ICC์ ๋น๊ณ ์ ์ (๊ทธ๋ฆผ 1)
๊ตญ์ ํ์ฌ ์ฌํ์ ์ง์ง์ฒด์ ๊ตฌ์กฐ ํน์ฑ ๋ฐ ๊ฐ์ธํฌ๋ฅผ ๋ฐฐ์์ ๊ฐ ICC์ ๋ฐํ ์กฐ๊ฑด์ ํจ๋ฅ์ ๋น๊ต์ ๋ํ ๋ํ์ ์ธ ๊ฒฐ๊ณผ๊ฐ ํ์ํ๊ณ ์๋์ ์ค๋ช ๋์ด ์์ต๋๋ค. ์ด๋ฌํ ๊ฒฐ๊ณผ์์ ์ฌ์ฉ ICC ๊ณจ๊ฒฉ ์กฐ๊ฑด์ 0 ฮผg์ / ใ (๋งจ๋ฐ), 20 ใ / ใ (์ฝ๋ผ๊ฒ 20), 200 ใ / ใ (์ฝ๋ผ๊ฒ 200) ๋ฐ 400 ใ / ใ (400 ์ฝ๋ผ๊ฒ) ๋ฐ ์ด๊ธฐ์ ์ฝ๋ผ๊ฒ ์ฝํ ๋์ด ํ-7.5 ์ ์๋ ์๋ 1 ร 6์ ๋๋ค.
์กฐ์ง ๊ณตํ ๋ฐํ ๋น ๋ฅด๊ฒ ๋ชจ๋ , ์ฌ์ ์ ์ง, ๋๋ ์ฝ๋ฌผ, ์ง๋ณ์ ์ฐ๊ตฌ, ๊ฐ๋ฐ, ์ฅ๊ธฐ ๊ต์ฒด ์์ฉ ํ๋ก๊ทธ๋จ์ ๋ํ ์กฐ์ง์ ๋ณต๊ตฌํ๋ ๋ฐ ํ์ํ ๋ฌผ๋ฆฌ์ , ์ํํ ์ ๋จ์, ๊ทธ๋ฆฌ๊ณ ๋ง์ ๋ค๋ฅธ 57๋ฅผ ์ ๊ณตํ๊ธฐ ์ํด ์งํํ๊ณ ์๋ค. ๊ฐ ์กฐ์ง ๊ณตํ์์ ์ฐจ ์ธ๊ฐ ๊ฐ์ธํฌ ๋น ๋ฅด๊ฒ ํ ๋ฒ ๋ชธ์์ ๊ฒฉ๋ฆฌ ๋์ฌ ๊ธฐ๋ฅ, ์์ง๋์ด๋ง ๋ฐํ์์ํ ํ๋ฅญํ ํ์์ฑ์ ์์ฑํ๊ณ ๊ฐ ๊ธฐ๋ฅ์ ์ ์งํ๊ธฐ ์ํด ํ๋ซํผ ๊ฐ๋ฐ์ ์๊ฒ๋ฉ๋๋ค. <.......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 mL PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
Glass slides | VWR | ย 631-1575 | Dimensions: 24ร60 mm |
Polystyrene spheresย | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 um; 3x10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
200 ยตL pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerateย | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
Paraffin Filmย | Parafilm Mย | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm^2 |
Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technologyย | 120008, 122300 | |
Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | From rat |
Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | 1X, w/o CaCl & MgCl; Ph = 7.2 |
Phosphate Buffered Saline (PBS)ย | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10x10ml |
Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)ย | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln | Lonza | 12-604F | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
APC49โHuh โ7.5 Cell Line | Apath | ||
100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37ยฐC, 5% Humidity |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit 'for mammalian cells | Life Technologies | L3224ย | |
CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
Infinite 200 PRO microplate readerย | Tecan | ||
Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
DAPI | Life Technologies | D3571 | |
Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
Chloroform | VWR | 22706.326 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
iScript Reverse Transcription Supermixย | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
Primers (to be chosen) | |||
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCHย |
ABOUT JoVE
Copyright ยฉ 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved