Fabrikasjon av invertert Kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Stillas: En Tredimensjonal Cell Culture plattform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Evnen til å opprettholde hepatocytt-funksjon in vitro, for det formål å teste xenobiotika 'cytotoksisitet, studere virusinfeksjon og utvikle medikamenter rettet mot leveren, krever en plattform der cellene får skikkelige biokjemiske og mekaniske signaler. Siste levervev tekniske systemer har ansatt tredimensjonale (3D) stillasene som består av syntetiske eller naturlige hydrogeler, gitt den høye vannretensjon og deres evne til å gi de mekaniske stimuli trengs av cellene. Det har vært en økende interesse for invertert kolloidale krystall (ICC) stillaset, en ny utvikling, noe som gir høy romlig organisering, homotypisk og heterotypic celle interaksjon, samt celle ekstracellulære matriks (ECM) interaksjon. Heri beskriver vi en protokoll for å fremstille ICC stillaset ved hjelp av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) og partikkel utvasking metoden. I korthet blir et gitter laget av mikropartikler, hvoretter en pre-polymer materialerr-løsning blir tilsatt, skal polymeriseres, og partiklene blir så fjernet, eller utlutes, ved hjelp av et organisk løsningsmiddel (for eksempel tetrahydrofuran). Oppløsningen av gitter resulterer i en svært porøs stillas med kontrollert porestørrelse og interconnectivities som tillater mediet å nå celler lettere. Denne unike struktur gjør det mulig med høyt overflateareal for cellene å overholde samt enkel forbindelse mellom porene, og evnen til å belegge PEGDA ICC stillas med proteiner viser også en markert effekt på celleytelse. Vi analyserer morfologien av stillaset, samt hepatokarsinom celle (Huh-7,5) oppførsel med hensyn til levedyktighet og funksjon for å utforske virkningen av ICC struktur og ECM belegg. Samlet sett gir dette papiret en detaljert protokoll av en fremvoksende stillaset som har brede programmer i tissue engineering, spesielt leveren tissue engineering.

Leveren er en svært vaskularisert organ med en rekke funksjoner, herunder avgiftning av blod, metabolisme av xenobiotika, og produksjonen av serumproteiner. Levervev har en kompleks tredimensjonal (3D) mikrostruktur, bestående av flere celletyper, galle canaliculi, sinus, og soner med forskjellig BioMatrix sammensetning og forskjellige oksygenkonsentrasjoner. Gitt denne forseggjort struktur, har det vært vanskelig å lage en passende leveren modell in vitro ^1. Imidlertid er det et økende behov for funksjonell in vitro-modeller hosting humane hepatocytter som plattformer for testing av legemiddeltoksisitet ² og studere sykdommer ....

1. ICC Stillas Fabrication (figur 1)

1. Klargjør polystyren (PS) innhegninger (diameter = 6 mm; 8-13 lag med perler).
   1. For å forberede formen, kutt tips av fra 0,2 ml koke-bevis mikrosentrifugerør på 40 ul nivå. Følge toppen av cut-rør til 24 x 60 mm ² mikroskop dekkglass slips med vanntett lim.
   2. Sett PS kuler (diameter = 140 mm) inneholdt i en vann-suspensjonen i et 20 ml hetteglass, forsiktig pipette ut vannet suspensjon, og tilsett 18 ml 70% etanolløsning i hetteglasset. Se.......

De representative resultater for den strukturelle karakterisering av ICC stillas og sammenligning av hver ICC stillas tilstand effekt ved dyrking hepatocytter er vist og forklart nedenfor. ICC stillasBetingelsene anvendt i disse resultatene er collagen belegg på 0 ug / ml (Bart), 20 ug / ml (Kollagen 20), 200 ug / ml (Kollagen 200) og 400 ug / ml (Kollagen 400) og den innledende Huh-7.5 celle seeding nummer er 1x10 ^6.

Tissue engineering stillasene er raskt utvikler seg til å gi alle de fysiske og biokjemiske signaler nødvendig for å regenerere, vedlikeholde eller reparere vev for anvendelse av orgel erstatning, studere sykdom, å utvikle medikamenter, og mange andre ^57. I leveren tissue engineering, primære humane hepatocytter raskt miste sine metabolske funksjoner gang isolert fra kroppen, og skaper et stort behov for ingeniører stillaser og utviklingsplattformer for å opprettholde leverfunksjon. Den nåværende

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) og konkurransedyktig forskning Programme (NRF-CRP10-2012-07).