Tillverkning av Inverted kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Scaffold: En tredimensionell cellkultur plattform för levervävnad Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Förmågan att upprätthålla hepatocyte funktion in vitro, i syfte att testa xenobiotika "cytotoxicitet, studera virusinfektion och utveckla läkemedel som riktar sig till levern, kräver en plattform där celler får rätt biokemiska och mekaniska signaler. Senaste levervävnad tekniska system har använt tredimensionella (3D) ställningar bestående av syntetiska eller naturliga hydrogeler, med tanke på deras höga vattenbindande och deras förmåga att ge de mekaniska stimuli som behövs av cellerna. Det har funnits ett växande intresse för den inverterade kolloidalt kristallen (ICC) byggnadsställning, en ny utveckling, vilket möjliggör hög rumslig organisation, homotypisk och hetero cell interaktion, liksom cell extracellulärt matrix (ECM) interaktion. Häri beskriver vi ett protokoll för att tillverka ICC ställningen med användning av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) och urlakningspartikelmetoden. Kortfattat är ett gitter tillverkat av mikrosfärpartiklar, varefter en i förväg polymer lösning tillsättes, korrekt polymeriseras, och partiklarna avlägsnas därefter, eller urlakas, med användning av ett organiskt lösningsmedel (t.ex. tetrahydrofuran). Upplösningen av gitterresulterar i en mycket porös scaffold med kontrollerade porstorlekar och interconnectivities som tillåter medier för att nå cellerna lättare. Denna unika struktur tillåter en hög ytarea för cellerna att vidhäfta till samt enkel kommunikation mellan porerna, och möjligheten att belägga PEGDA ICC scaffold med proteiner visar också en markant effekt på cellprestanda. Vi analyserar morfologi ställningen samt hepatokarcinom cellen (Va-7,5) beteende när det gäller lönsamhet och funktion för att undersöka effekten av ICC struktur och ECM beläggningar. Sammantaget ger detta papper ett detaljerat protokoll av en framväxande byggnadsställning som har breda tillämpningar inom tissue engineering, särskilt levervävnadsteknik.

Levern är ett mycket vaskulariserad organ med en mängd funktioner, inklusive avgiftning av blodet, metabolism av xenobiotika, och produktionen av serumproteiner. Levervävnad har en komplex tredimensionell (3D) mikrostruktur, bestående av flera celltyper, gallcanaliculi, sinuskurvor, och zoner med olika biomatris sammansättning och olika syrekoncentrationer. Med tanke på detta noggrant struktur, har det varit svårt att skapa en ordentlig levermodell in vitro ^en. Det finns dock en ökande efterfrågan på funktionella in vitro-modeller värd humana hepatocyter som plattformar för att testa läkemedelstoxicitet ² och studera sjukdomar ....

1. ICC Scaffold Fabrication (figur 1)

1. Förbered polystyren (PS) gitter (diameter = 6 mm, 8-13 lager av pärlor).
   1. För att förbereda formen, klippa tips bort från 0,2 ml koka säkra mikrocentrifugrör på 40 pl nivå. Vidhäfta toppen av cut-rören till 24 x 60 mm ² mikroskop täckglas halk med vattentätt lim.
   2. Sätt PS sfärer (diameter = 140 pm) som finns i en vattensuspension i en 20 ml flaska, försiktigt pipett ur vattnet fjädring, och tillsätt 18 ml av 70% etanollösning.......

De representativa resultat för strukturbestämning av ICC ställningen och jämförelse av varje ICC ställnings tillstånd effektivitet i odling hepatocyter visas och förklaras nedan. ICC ställnings betingelser som användes i dessa resultat är kollagen beläggningar av 0 | ig / ml (Bare), 20 | ig / ml (Kollagen 20), 200 | ig / ml (Kollagen 200), och 400 | ig / ml (Kollagen 400) och den initiala va-7,5 cell sådd antal är 1x10 ^6.

Vävnadstekniska byggnadsställningar utvecklas snabbt för att ge alla de fysiska och biokemiska signaler som är nödvändiga för att regenerera, underhålla eller reparera vävnad för tillämpningen av ersättnings organ, studera sjukdomar, utveckling av läkemedel och många andra ^57. I levervävnadsteknik, primära humana hepatocyter förlorar snabbt deras metaboliska funktioner när isolerade från kroppen, vilket skapar ett stort behov av tekniska ställningar och utveckla plattformar för att upprä.......

Författarna vill erkänna stöd från en National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) och konkurrenskraftig forskning (NRF-CRP10-2012-07).