Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

Zusammenfassung

Diese Arbeit stellt eine einfache und visuelle Methode Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform zu erfassen. Mit dem vorgeschlagenen Verfahren wird das gesamte Experiment, einschließlich Tropfenmanipulation und zum Nachweis von Mehr nucleotide polymorphisms, kann in der Nähe von 23 ° C ohne Zuhilfenahme moderner Instrumente durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Eine einfache und visuelle Methode Multi-Nukleotid-Polymorphismus (MNP) zu erfassen wurde auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform auf einer offenen Fläche ausgeführt. Dieser Ansatz zur farbmetrischen DNA-Nachweis auf der Hybridisierung vermittelte Wachstum von Gold-Nanopartikel-Sonden (AuNP Sonden) basiert. Die Wachstums Größe und Konfiguration des AuNP werden durch die Anzahl von DNA-Proben mit den Sonden hybridisierten dominiert. Auf der Grundlage der spezifischen größen- und formabhängigen optischen Eigenschaften der Nanopartikel, die Anzahl von Fehlpaarungen in einer Proben-DNA-Fragment an die Sonden können unterschieden werden. Die Versuche wurden über jeweils Tröpfchen durchgeführt, enthaltend Reagenzien und DNA-Proben und wurden transportiert und an der pneumatischen Plattform mit dem gesteuerten pneumatischen Ansaugen des flexiblen PDMS-basierten superhydrophoben Membran gemischt. Droplets können gleichzeitig und präzise auf eine offene Fläche an der vorgeschlagenen pneumatischen Plattform geliefert werden, die ohne Neben eff hoch biokompatibelect von DNA-Proben in den Tröpfchen. Die Kombination der beiden vorgeschlagenen Verfahren kann das multi-Nukleotid-Polymorphismus auf den Blick auf den pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform detektiert werden; kein zusätzliches Gerät erforderlich ist. Das Verfahren von der Installation der Tröpfchen auf der Plattform zum Endergebnis in weniger als 5 min, viel weniger als mit bestehenden Methoden. Darüber hinaus erfordert diese kombinierte MNP Detektionsansatz ein Probenvolumen von nur 10 & mgr; l in jede Operation, die bemerkenswert geringer ist als die eines Makrosystem.

Einleitung

Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), die eine einzelne Basenpaarunterschied in einer DNA-Sequenz ist, ist eine der häufigsten genetischen Veränderungen. Aktuelle Studien berichten , dass SNPs mit Erkrankungsrisiko assoziiert sind, Wirksamkeit von Medikamenten und Nebenwirkungen von Individuen durch die Genfunktion zu beeinflussen. ^1,2 Jüngste Studien zeigten auch , dass zwei- oder mehrPunktMutationen (Multi-nucleotide polymorphism) verursachen bestimmte Krankheiten und individuelle Unterschiede in den Auswirkungen der Krankheit. ^3,4 der Nachweis von Nukleotid - Polymorphismus ist in prescreening Krankheit daher unerlässlich. Einfache und effiziente Verfahren zum schnellen Nachweis von sequenzspezifischen Oligonucleotide wurden in den letzten zwei Jahrzehnten hoch entwickelt. ^1,5 Aktuelle Ansätze DNA Mutationen umfassen typischerweise Verfahren , einschließlich Sonde Immobilisierung, Fluoreszenzmarkierung, Gelelektrophorese, usw., zu identifizieren ^6,7 aber diese Methoden erfordern in der Regel einen langen analytischen Prozess, Expensive Ausrüstung, gut ausgebildete Techniker und signifikanten Verbrauch von Proben und Reagenzien.

Ein Nanopartikel mit einem großen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen und einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften ist ein ideales Material als hochempfindliche und billige Detektionsplattform für spezifische Biomarker. Gold - Nanopartikel (AuNP) zur DNA - Detektion weit verbreitet wegen ihrer großen Fähigkeit , mit Oligonukleotid - Sonden modifiziert werden. ^8-10 SNP Detektionstechniken wurden auch AuNP entwickelt worden war . ^11-13 In dieser Arbeit wurde ein neues farbmetrischen Ansatz der zu erkennen Multi-Nukleotid - Polymorphismus (MNP) , durch DNA - Hybridisierungs vermittelte Wachstum von AuNP Sonden. ¹⁴ Diese einfache und schnelle Sondieren Verfahren liegt die Theorie zugrunde , daß vielfältige Längen von Einzelstrang - DNA (ssDNA) oder Doppelstrang - DNA (dsDNA) , konjugiert mit AUNP das Wachstum Größe und Form des AuNP beeinflussen (siehe Abbildung 1). ¹⁵ diese Methode der DNA - Nachweisverfügt über einen kleinen Verbrauch von Reagenzien eine kleine Testdauer (wenige Minuten) und ein einfaches Verfahren ohne thermische Kontrolle, die prospektiv anwendbar für die klinische Diagnostik und häusliche medizinische Untersuchung ist.

Mehrere Mikrofluidik - Systeme , die die DNA - Sequenz zu detektieren , wurden entwickelt; ¹⁶ Diese mikrofluidischen Systemen, von traditionellen experimentelle Protokolle entwickelt, weniger Stücke von Großgeräten und vereinfacht die experimentellen Protokolle erforderlich , um die Empfindlichkeit, die Nachweisgrenze und Spezifität der DNA zu verbessern Biosensor. DNA Detektionsmethoden in der mikrofluidischen Systeme noch erfordern jedoch Instrumente einem nachfolgenden Prozess , wie beispielsweise einer PCR (Polymerasekettenreaktion) Maschine zur Signalverstärkung und einem Fluoreszenzlesegerät für eine einzige Auslesung des heterogenen SNP zu identifizieren. ^17,18 eine einfache Entwicklung Plattform ohne die nachfolgende Verarbeitung zu multi-nucleotide polymorphism ausgelesen direkt die Ergebnissesehr wünschenswert ist. Im Vergleich zu gut genutzt, herkömmlichen, geschlossenen mikrofluidischen Systemen, die offene Oberfläche Mikrofluidiksystemen verheißungs mehrere Vorteile, wie zum Beispiel einem klaren optischen Weg, eine einfache Möglichkeit, den Zugriff auf die Probe, eine direkte Umwelt Zugänglichkeit und nicht leicht gebildet Kavitation oder Grenzflächen Behinderung bieten in der Kanal. ¹⁹ Unsere bisherigen Arbeit führte eine einfache pneumatische Plattform für Open-Oberfläche Tröpfchenmanipulation (siehe Abbildung 2). ²⁰ Auf dieser Plattform Tröpfchen können gleichzeitig transportiert und manipuliert werden , ohne Einmischung von einer Antriebsenergie eine Saugkraft verwendet, die eine hat ein großes Potenzial in der biologischen und chemischen Anwendungen. Diese pneumatische Plattform wurde so die Manipulation von DNA-Proben für MNP Detektion in Kombination mit dem kolorimetrischen Ansatz unter Verwendung des Konzepts der DNA-Hybridisierungs vermittelte Wachstum von AuNP Sonden auszuführen verwendet.

Das Protokoll in diesem Papier beschreibteine einfache visuelle Erkennung von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform auf einer offenen Fläche. Diese Arbeit bestätigt, dass die multi-Nukleotid-Polymorphismus mit dem bloßen Auge nachweisbar ist; die vorgeschlagene pneumatische Plattform für biologische und chemische Anwendungen geeignet.

Protokoll

1. Verfahren zum Erkennen von MNP

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Verfahren, das MNP basierend auf der Hybridisierung vermittelte Wachstum von Gold-Nanopartikeln zu erkennen.

1. Bereiten Sie die DNA-Sonde (5'-Thiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') Lösung bei einer Konzentration von 100 uM.
2. Bereiten Sie die Sonde DNA-modifizierten AuNP (AuNP Sonde) Partikel. ²¹
   Hinweis: Die Lautstärke hier hängt von der Anforderung der Sonde DNA-modifizierten AuNP (AuNP Sonde) Teilchen verwendet. Es ist daher abhängig von der Anzahl von Experimenten durchgeführt werden. Wir bereiten typischerweise überschüssige AuNP Meßteilchen als Ersatzteile. Das Volumen in diesen Schritten verwendet ist einstellbar und flexibel.
   1. Hinzufügen Sonden-DNA (100 & mgr; M, hergestellt in Schritt 1,1) zu einer Lösung von Gold-Nanopartikeln (13 nm, 17 nm) bei einer Konzentration von 1 OD / ml.
   2. Bringen die Endkonzentrationen von Natriumdodecylsulfat (NaC ₁₂ H ₂₅ SO _4, SDS) und Phosphatpuffer (PBS) mit 0,01% und 0,01 M, respectively.
   3. Nach 20 min bringt die Konzentration von Natriumchlorid (NaCl) und 0,05 M mit einer Lösung von NaCl (2 M) und PBS (0,01 M), während SDS bei 0,01% und Inkubation für 20 min beibehalten wird.
   4. Erhöhung der NaCl-Konzentration in Schritten von 0,1 M bis zu einer Endkonzentration von 1 M über 20 min Intervallen.
   5. Inkubieren über Nacht mit bei 23 ° C auf einem Vortex-Mixer schütteln. Die Schüttelgeschwindigkeit wirkt sich nicht auf das Experiment, solange die DNA-Proben und AuNP Sonden hybridisiert werden.
   6. Zentrifugieren Sie die Gold-Nanopartikel bei 7.000 × g für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand.
3. In AuNP Meßteilchen in entsalztes Wasser (VE-Wasser) bei einer Konzentration von 25 nM (AuNP Sondenlösung).
4. Bereiten Ziel - DNA - Proben (vollständig komplementär: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 ', drei Basenpaar - mismatched: 5'-TTT CTTGCCTAC ACCAGCTC-3', sechs Basenpaar mismatched: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') in Konzentrationenvon 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respectively.
5. In AuNP Sondenlösung (6 & mgr; l, 25 nM) in die DNA-Proben (350 ul) mit NaCl (14 & mgr; M).
6. Schütteln der Mischung von DNA-Proben und AuNP Sonden mit einem Vortex-Mischer bei 23 ° C für 5 min für die DNA-Hybridisierung.
7. Für AuNP Wachstum, fügen NH ₂ OH (6 ul, 400 mM) und HAuCl ₄ (6 & mgr; l, 25,4 mM) zu der Lösung (die Mischung von DNA - Proben und AuNP Sonden). Das Wachstum von AuNP dauert ca. 30 sec für die Fertigstellung. Die stetige Veränderung der Färbung unterhält mehr als 1 Stunde.
   ACHTUNG: Der Hautkontakt mit HAuCl ₄ könnte schwere toxische Wirkungen hervorrufen. Bitte beachten Sie die geltenden Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Bitte tragen Sie Handschuhe und ein Abzug verwenden bei der Verwendung von HAuCl _4.

2. Herstellung eines pneumatischen Droplet Manipulation Platform

Hinweis: Das PDMS-basierte Tröpfchenmanipulationsplattform besteht aus zwei Komponenten: a PDMS-Membran (100 & mgr; m) mit einer superhydrophoben Oberfläche und einer Luftkanalschicht (5 mm). Ohne einen MEMS-Prozess wurden die gemeinsamen Bearbeitungsverfahren verwendet, um diese Vorrichtung herzustellen, die Computer-numerischen Steuerung (CNC) Mikrobearbeitung zur Herstellung einer Form, PDMS Gießen und Replikation für das Rapid Prototyping von mikrofluidischen Komponenten und Laser-Mikrobearbeitung für die Herstellung umfasst von ein super-hydrophobe Oberfläche (siehe Abbildung 3).

1. Verwenden Sie die CNC - Maschine mit einem Bohrer (0,5 mm) ausgestattet PMMA-Basis - Master zur Herstellung von Formen (siehe Abbildung 3) mit Mikrostrukturen. Verwenden Sie eine Vorschubgeschwindigkeit des Bohrers 7 mm / s und einer Drehrate 26.000 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie ein Luftgebläse und DI-Wasser die PMMA Schrott zu entfernen und die Oberfläche der Masterform zu reinigen.
2. Bereiten eines Gemisches aus dem PDMS Basis und dem Härter in einem Verhältnis 10: 1. Entgasen das Gemisch in einem Exsikkator für 30 Minuten, oder bis alle Luftblasen entfernt werden.
3. Gießen Sie die PDMS in the Masterform und backen Sie die PDMS für 3 Stunden bei 60 ° C im Ofen der inversen Mikrostrukturen der Luftkammern (PDMS-Membran) und Luftkanäle (PDMS-Schicht) zu erhalten.
4. Entfernen Sie die PDMS-Schicht aus der Urform (von Hand). Stanzlöcher auf der PDMS-Schicht für Luft-Ansaugöffnungen.
5. Setzen Sie die PDMS-Membran, die PDMS-Schicht und das Glassubstrat in die Kammer des Sauerstoff-Plasma-Behandlungssystem. Nach Sauerstoff-Plasmabehandlung, binden die PDMS-Membran, die PDMS-Schicht und dem Glassubstrat zusammen auf einer Heizplatte (90 ° C) für 10 min.
6. Setzen Sie den Composite-Chip in den Laser-Schneidemaschine (PDMS Membranseite nach oben). Importieren Sie die DWG-Datei die superhydrophoben Bereich (15 mm × 12 mm) zu definieren. Siehe Abbildung 3. Direkt gravieren die PDMS - Membran mit einem CO ₂ -Laser Maschine die superhydrophoben Bereich auf der PDMS - Membran (Leistung 12 W, Scangeschwindigkeit 106,68 mm / sec) zu erstellen.
7. Reinigen Sie die superhydrophoben Oberfläche mit DI-Wasser zu waschendie carbonisierten Rückstände auf der Oberfläche entfernt.
8. Schließen Sie den Luft Saugeinlass und Vakuumpumpe durch ein Magnetventil (siehe Abbildung 4). Verbinden des Magnetventils mit dem Computer und die Steuerung mit einer digitalen I / O USB-Modul.

3. Betrieb zum Nachweis von MNP auf der Pneumatik-Plattform

Hinweis: In diesem Abschnitt wird die Operation beschreibt colorimetrisch und schnell die MNP an der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform (siehe Abbildung 5) zu identifizieren. Alle Schritte erfolgen bei 23 ° C (Umgebungstemperatur) und die relative Luftfeuchtigkeit 85%.

1. Legen Sie die Ziel-DNA-Probe Tröpfchen (10 & mgr; l, 0,5 & mgr; M) auf der superhydrophoben Bereich der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform.
2. Legen Sie die AuNP Sonde Tröpfchen (10 & mgr; l, 25 nM) auf der superhydrophoben Bereich der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform.
3. Steuern die Luftansaugung der Auslenkung der PDMS-Membran mit einem Magnetventil und einem Si zu bewirkenmple Programm (zB Labview). Luftansaugung in jeder Luftkammer bereitzustellen, entlang der Migrationspfad der Tröpfchen (die Ziel-DNA und Sonden AuNP respectively) auf dem PDMS-Membran, so daß die Tröpfchen miteinander kollidieren und sich vereinigen. Verwenden Sie einen Arbeitsdruck der Vakuumpumpe von -80 kPa (Überdruck).
   1. Alternativ dazu steuern die Luftansaugung manuell solange die Tröpfchen vollständig vermischt ist. Mit der Hand, verbinden oder die Vakuumpumpe und Einlässen Luftkammer mit Rohren in den frühen Stadien der Prüfung trennen.
4. Kontrollieren Sie die Luftansaugung der verschmolzenen Tröpfchen vorwärts und rückwärts zu rollen, die Mischeffizienz für 3 Minuten mit dem Steuerungssystem des Magnetventils zu verbessern. Die Ziel-DNA und AuNP Sonden werden gut gemischt und innerhalb von 3 min hybridisiert. Verwenden einer Antriebsfrequenz und ein Arbeitsdruck von 5 Hz und -80 kPa (Überdruck), respectively.
5. Legen Sie ein Tröpfchen enthält , NH ₂ OH (2 ul, 400 mM) und HAuCl4 (2 & mgr; l, 25,4 mM) auf der superhydrophoben Bereich des pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform.
6. Kontrollieren Sie die Luftansaugung (-80 kPa Überdruck) die Tröpfchen miteinander und coalesce kollidieren zu lassen. Dann steuern die Luftansaugung (5 Hz und -80 kPa Überdruck) die koaleszierten Tröpfchen Rolle vorwärts und rückwärts zu lassen, die Mischeffizienz für 1 min zu erhöhen.
7. Messen und die Farbe des koaleszierten Tröpfchen mit dem bloßen Auge aufzunehmen.

Ergebnisse

unter Verwendung eines einfachen und neuartigen Nachweismethode durch die DNA-Hybridisierung vermittelte Wachstum der AuNP Sonden in dieser Arbeit wurden drei DNA-Proben getestet. Die Sequenzen der Sonden-DNA und DNA-Proben von drei Arten, nämlich, CDNA, TMDNA (drei Basenpaar nicht übereinstimmen DNA) und SixMDNA (sechs Basenpaar nicht übereinstimmen DNA) aufgelistet sind in Protokoll Schritt 1 (völlig komplementäre DNA-Sonde). die Fehlpaarungen an die Sonde der hier getesteten DNA ...

Diskussion

In diesem Protokoll zu erfassen ein einfaches kolorimetrisches Verfahren kann MNP bei Konzentrationen von 0,11 bis 0,50 & mgr; M in Mikrozentrifugenröhrchen Bereich realisiert werden. Darüber hinaus ist die vorgeschlagen MNP Detektionsverfahren auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform durchgeführt, die für die DNA-Screening und andere biomedizinische Anwendungen ein hohes Potential aufweist. In der Praxis hängt der detektierbare Bereich der Proben-DNA-Konzentration auf die Mischeffizienz der Bet...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184
benchtop engravers	Roland DG	EGX-400
laser cutting machine	Universal Laser Systems, Inc.	VLS 3.50
Oxygen plasma treatment system	Femto Science Inc. Korea	CUTE-MPR
solenoid valve			home built
vacuum pump	ULVAC KIKO, Inc.	DA-30D
13-nm AuNP solution	TAN Bead Inc., Taiwan	NG-13
DNA (with 5'-end labeled thiol)	MDBio, Inc., Taiwan
phosphate buffered saline (PBS)	UniRegion Bio-Tech,. Taiwan	PBS001-1L
sodium dodecyl sulfate (SDS)	J. T. baker	4095-04
Hydroxylamine solution (NH2OH)	Sigma-Aldrich	467804
Chloroauric acid (HAuCl4)	Sigma-Aldrich	G4022
sodium chloride (NaCl)
vortex mixer	Digisystem Laboratory Instruments Inc.	VM-2000
centrifuge	Hermle Labortechnik GmbH.	Z 216 MK