JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Abstract

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.

The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Introduction

معظم الحيوانات تعتمد بشكل كبير على الحواس الكيميائية وأثرها على التفاعل مع محيطهم. حاسة الشم ويلعب دورا أساسيا لإيجاد وتقييم المواد الغذائية، وتجنب الحيوانات المفترسة وتحديد شركاء التزاوج مناسبة. في معظم الثدييات، يتكون نظام حاسة الشم لا يقل عن أربعة أنظمة فرعية هامشية تشريحيا ومتميزة وظيفيا: ظهارة الرئيسية حاسة الشم 1،2، العقدة Grueneberg 3،4، الجهاز الحاجز من ماسيرا 5،6 والجهاز الميكعي. تضم VNO هيكل الحسي المحيطي للنظام حاسة الشم الإكسسوارات (الدعم الإداري والتشغيلي)، والذي يلعب دورا رئيسيا في الكشف عن العظة الكيميائية التي تنقل معلومات حول هوية والجنس والطبقة الاجتماعية ودولة الجنسية 7-10. يقع VNO في قاعدة الحاجز الأنفي الحق فوق الحنك. في الفئران، وهو أنبوب تنتهي أعمى الثنائي المغلقة في كبسولة الغضروفية 11-13. يتكون الجهاز من كل من epithe الحسية وسطي على شكل هلالlium التي تؤوي في VSNs وجزء غير الحسي على الجانب الوحشي. بين كل من ظهائر يكمن مليئة المخاط التجويف وهذا مرتبط إلى تجويف الأنف عن طريق القناة الميكعي الضيق 14. والاوعية الدموية الجانبية كبيرة في الأنسجة غير الحسية يوفر آلية ضخ الأوعية الدموية لتسهيل دخول كبيرة نسبيا، والجزيئات ومعظمهم من غير المتطايرة مثل الببتيدات أو بروتينات صغيرة في التجويف VNO من خلال الضغط السلبي 15،16. المكونات الهيكلية للVNO موجودة عند الولادة والجهاز يصل حجم الكبار قبل سن البلوغ 17 قريبا. ومع ذلك، ما إذا كان الدعم الإداري والتشغيلي القوارض بالفعل وظيفية في الأحداث لا تزال موضع نقاش 18-20.

وتتميز VSNs من قبل كل من موقعها الظهارية ونوع من المستقبلات التي تعبر عنها. تظهر VSNs التشكل القطبين مع محور عصبي امياليني والتغصنات قمي واحدة أن يبرز نحو التجويف وينتهي في مقبض الباب شجيري microvillous. VSN الفأسإضافات fasciculate لتشكيل العصب الميكعي أن يترك كبسولة الغضروفية في نهاية ظهراني الذيلية، يصعد على طول الحاجز، يمر لوحة مثقب والمشاريع إلى البصلة الشمية الإكسسوارات (AOB) 21،22. تتكون الظهارة الحسية الميكعي من طبقتين: تقع طبقة قمي أقرب إلى الجانب اللمعية والموانئ على حد سواء V1R- ولكن كل نوع واحد من FPR-RS، معربا عن الخلايا العصبية. هذه الخلايا العصبية coexpress مجموعة البروتين α-فرعية G αi2 والمشروع في الجزء الأمامي من AOB 23-25. الخلايا العصبية الحسية الموجودة في طبقة أكثر القاعدية V2Rs صريحة أو FPR-RS1 جنبا إلى جنب مع مجموعة αo وترسل المحاور الخاصة بهم إلى المنطقة الخلفية لAOB 26-28.

ومن المرجح تنشيط الخلايا العصبية الميكعي التي كتبها semiochemicals صغيرة بدلا 29-33 (V1Rs) أو المركبات البروتينية 34-38 (V2Rs) التي تفرز في مختلف سوائل الجسم مثل البول واللعاب والسائل المسيل للدموع 37،39-41 وفي التجارب الموقع قد أظهرت أن VSNs تنشط أيضا الببتيدات formylated ومختلف المضادة للميكروبات / مركبات مرتبطة التهاب 25،42. وعلاوة على ذلك، أعرب heterologously FPR-RS البروتينات حصة أطياف ناهض مع FPRs أعرب في الجهاز المناعي، مما يشير إلى دور محتمل كما كشف عن لمرض في conspecifics أو المصادر الغذائية الفاسدة 25 (أنظر المرجع 43).

أساسية لفهم العلاقات مستقبلات يجند وشلالات الإشارات المصب في فئات معينة من السكان VSN هو تقييم مفصل للخصائص الفيزيائية الحيوية الأساسية في بيئة المحلية. في الماضي، وتحليل الإشارات الخلوية قد استفاد كثيرا من الحيوانات المعدلة وراثيا التي تميز مجموعة محددة من الخلايا العصبية التي كتبها coexpressing بروتين علامة فلوري 30،44-49. في هذا البروتوكول، خط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن FPR-RS3 جنبا إلى جنب مع علامة فلوري (FPR-RS3-ط-الزهرة) ويستخدم.يجسد هذا النهج كيفية توظيف هذا سلالة الماوس المعدلة وراثيا لإجراء تحليل الكهربية من سكان الخلية التعرف بصريا باستخدام الخلايا العصبية واحدة تسجيلات التصحيح المشبك في شرائح الأنسجة VNO الاكليلية الحادة. وضغط يحركها الهواء متعددة برميل نظام نضح للمؤثرات الحسية وكلاء الدوائية يسمح سريع، عكسها والتنسيق تحفيز الخلايا العصبية أو تثبيط خلال التسجيلات. تسجيلات خلية كاملة في الأعمال التحضيرية شريحة تسمح لتحليل مفصل لخصائص ذاتية، المواصلة تنشيط الجهد، فضلا عن اتخاذ إجراءات أنماط التصريف المحتملة في البيئة المحلية للخلية.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات الحيوانية في الامتثال للتشريعات المحلية والاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية (التوجيه 86/609 / EEC) ومع التوصيات التي طرحها الاتحاد من المختبر الأوروبي الحيوان جمعيات العلوم (FELASA). ويضم كل من C57BL / 6 الفئران والجرذان FPR-RS3-ط-الزهرة في مجموعات من كلا الجنسين في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 شهرا ساعة دورة الضوء / الظلام مع الغذاء والماء المتاحة الإرضاع بحسب الرغبة. للتجارب استخدمت صغار البالغين (6-20 أسابيع) من كلا الجنسين. لم يلاحظ أي اختلافات واضحة تعتمد على نوع الجنس.

1. الحل تحضير

  1. إعداد الخلية حل S 1: 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-ethanesulfonic حمض (HEPES) مخزنة حل خارج الخلية التي تحتوي على (مم) 145 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 1 CaCl 2، 1 MgCl 2، 10 HEPES. الرقم الهيدروجيني = 7.3 (معدلة مع هيدروكسيد الصوديوم)؛ الأسمولية = 300 ملي أوزمول (معدلة مع الجلوكوز).
  2. إعداد extracelluلار حل S 2: المؤكسج كربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2) حل خارج الخلية التي تحتوي على (مم) 125 كلوريد الصوديوم، و 25 NaHCO 3، 5 بوكل، 1 CaCl 2، 1 MgSO 4، 5 BES. الرقم الهيدروجيني = 7.3. الأسمولية = 300 ملي أوزمول (معدلة مع الجلوكوز).
  3. إعداد 4٪-التبلور انخفاض درجة الحرارة الحل الاغاروز (S 3) لتضمين الأنسجة: 4٪، التبلور درجات حرارة منخفضة الاغاروز. حل 2 غرام منخفضة التبلور-الاغاروز في 50 مل من S 1 في زجاجة مختبر الزجاج 100 مل جنبا إلى جنب مع محرك مغناطيسي. لإذابة الاغاروز، ووضع الزجاجة في حمام مائي (مع غطاء لا مغلقة بإحكام) عند 70 درجة مئوية لمدة حوالي 20 دقيقة أو حتى يصبح شفافا الحل مع التحريك. تهدئة والحفاظ على الاغاروز ذاب في حمام مائي الثاني في 42 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  4. إعداد الخلايا حل S 4: ماصة محلول يحتوي على (مم) 143 بوكل، 2 كوه، 1 EGTA، 0.3 CaCl 2 (مجاني الكالسيوم 2+ = 110 نانومتر)، 10 HEPES، 2 MgATP، 1 NaGTP.الرقم الهيدروجيني = 7.1 (معدلة مع KOH)؛ الأسمولية = 290 ملي أوزمول.
  5. تعديل / ضبط تشكيل S 1، S 2 و S 4 وفقا لتصميم التجارب الفردية (على سبيل المثال، حاصرات الدوائية لعزل أنواع معينة من التيارات تنشيط الجهد).

2. مساحة التحضير

  1. ملء بالاكسجين شريحة تخزين غرفة مع S 2 لا يقل عن 30 دقيقة قبل التشريح، ومكان على الجليد لدرجة الحرارة ودرجة الحموضة تعديل وحل الأوكسجين بشكل مستمر.
  2. ملء خزان للsuperfusion شريحة في تسجيل الإعداد مع S 2 والأوكسجين بشكل مستمر.
  3. قبل التشريح، وملء vibratome غرفة مع S 2 و ترتيب الثلج المجروش في جميع أنحاء الغرفة. بدلا من ذلك، نقل قطع الجليد الباردة حل المؤكسج من بالاكسجين غرفة إلى غرفة vibratome والحفاظ على بالاكسجين بشكل مستمر.
  4. ترتيب الأدوات الجراحية والمواد الاستهلاكية.
  5. وضع حزمة هلام الجليد تحت تشريحالمجهر، وتغطي مع منشفة ورقية لمنع الأنسجة VNO من تجميد لقاع الطبق.
  6. شفرة حلاقة نظيفة من قبل الشطف لفترة وجيزة في 70٪ من الإيثانول والماء المقطر وجبل لvibratome. لاستبدال كل دورة تشريح.

3. VNO تشريح والتضمين

  1. التضحية الحيوانية التعرض قصيرة إلى CO 2 وقطع رأس باستخدام مقص جراحي حادة. ملاحظة: مع مرور الوقت من التضحية الحيوانية لوضع كبسولة VNO على الجليد أمر بالغ الأهمية، تقليل الوقت إلى أقل من 2 دقيقة. للمحافظة على سلامة الأنسجة، وتضمين كل من VNOs تشريح كامل في الاغاروز في أقل من 30 دقيقة.
  2. إزالة الفك السفلي مع مقص جراحي كبير. أدخل من خلال تجويف الفم وقطع عظام الفك السفلي وعضلات كل جانب على حدة.
  3. ضع الجزء المتبقي من رأس رأسا على عقب في طبق بتري كبير.
  4. سحب بعيدا الجلد من الفك العلوي وحول غيض من الأنف مع ملقط المتوسطة للحصول على فرص أفضل للوصول إلىالقواطع.
  5. استخدام مقص العظام إلى قطع الجزء الأكبر من القواطع في ~ 45 درجة زاوية في اتجاه منقاري (الشكل 1A). وسوف يخفف هذا إزالة الكبسولة VNO من تجويف الأنف.
    ملاحظة: لا قطع لجذور الأسنان لمنع الأضرار التي لحقت غيض من كبسولة VNO.
  6. الاستيلاء على الحنك العلوي جامدة في جزء منقاري مع ملقط المتوسطة وقشر مرة أخرى بعناية في قطعة واحدة في كل زاوية مسطحة (الشكل 1B).
    ملاحظة: شطف مرارا وتكرارا مع الثلج البارد S 2.
  7. استخدام مقص الربيع الصغيرة لخفض الانصهار عظمي بين غيض من العظام الميكعة والفك. إدراج نصائح مقص مع الجزء المنحني من طرف لافتا إلى الخارج بعيدا عن VNO وبعناية قطع العظام في خطوات صغيرة على كل من اليسار والجانبية الجانب الأيمن إلى كبسولة VNO.
  8. لإزالة كبسولة VNO، استخدم مقص الربيع الصغيرة إلى قطع طريق العظام الميكعة في الجزء الذيلية ورفع بعناية العظام الميكعة من نعسل تجويف باستخدام ملقط المتوسطة. على الفور نقل VNO إلى طبق بتري صغيرة تحت المجهر ستيريو على حزمة هلام الجليد حيث سيتم تنفيذ الخطوات المتبقية من تشريح.
  9. شطف VNO في كمية صغيرة من الجليد الباردة S 2 لمنع الأنسجة من الجفاف.
  10. فصل كبسولات الغضروفية التي تحتوي على الأنسجة VNO الناعمة عن طريق الاستيلاء على الجزء الخلفي من العظام الميكعة مع ملقط المتوسطة. ضع كبسولة للحصول على عرض ظهري بحيث انقسام بين كلا VNOs تصبح مرئية (1D الشكل الأول).
  11. استخدام غيض من ملقط غرامة لفصل كل من الغضروف كبسولات VNO من العظم المركزي مع الحفاظ على العظام الميكعة تمركزها في الجزء الخلفي.
    ملاحظة: استخدام ملقط فقط على حافة الكبسولة الغضروف ويكون حريصا جدا على ألا يخترق من خلال الغضروف كما تلف الظهارة الحسية الحساسة بسهولة.
  12. مرة واحدة يتم فصل VNOs اثنين، بدء إزالة الغضروف التغليف التنوبر VNO.
  13. الاستيلاء على حافة العليا للكبسولة واحدة مع غرامة ملقط وانفصل الجدار الغضروف الذي كان يعلق سابقا إلى العظام الميكعة (الجانب الإنسي).
  14. لإزالة ما تبقى الغضروف تحويل VNO مع الجانب الوحشي منحني لأسفل الطبق وآمن دبوس أسفل الغضروف على جانب واحد باستخدام ملقط. بعناية نقل ملقط غرامة الثانية من الجانب الخلفي في زاوية مسطحة جدا بين الغضروف وVNO لتخفيف اتصال بين الأنسجة والغضاريف.
  15. ببطء قشر VNO بعيدا عن غضروف بوضعها في طرف الذيلية لها، لتجنب إلحاق الضرر الظهارة الحسية.
  16. بمجرد أخرج من VNO من الكبسولة، تأكد من إزالة جميع أجزاء الغضاريف الصغيرة المتبقية عن أي القطع المتبقية من الغضروف وفصل الأنسجة المحيطة من الاغاروز أثناء عملية التقطيع.
  17. وضع قطرة صغيرة من الجليد الباردة S 2 في أول VNO تشريح لمنع تلف الأنسجة. وعاء دموي كبير على فيل الجانب الوحشيل تصبح مرئية مشيرا إلى أن الجهاز لا يزال قائما ولم يتضرر بشكل فادح أثناء تشريح (الشكل 2A الثاني). في حالة الأوعية الدموية حصلت اضرار، فإنه لا يزال من المفيد الاستمرار في تشريح VNO طالما انها لم تضعف التشكل العام بشكل واضح مع.
  18. على الفور تشريح VNO الثاني.
  19. لتضمين VNOs، وملء كل من أطباق بتري الصغيرة لحافة مع S ذاب 3 (المخزنة في حمام مائي عند 42 درجة مئوية، وانظر 1.3).
  20. عقد VNO في نهاية الذيلية أوسع مع ملقط غرامة لتجنب الأضرار التي لحقت ظهارة حسية.
  21. تزج VNO في الاغاروز وتحريكه أفقيا ذهابا وإيابا عدة مرات لإزالة الفيلم من حل خارج الخلية، وكذلك أي فقاعات الهواء من سطحه.
  22. ضع VNO عموديا مع طرف الذيلية التي تواجه قاع الطبق. بدلا من معسر VNO مع ملقط مباشرة، وضبط التوجه عن طريق تحريك طرف الملقط في proximi قريبتي واي لVNO.
    ملاحظة: اتجاه خلال تضمين أمر بالغ الأهمية لأنه يحدد الطائرة شريحة والوصول إلى الخلايا العصبية الحسية أثناء التجربة.
  23. وضع الأطباق على كيس من الثلج هلام والانتظار حتى عزز الاغاروز.
    ملاحظة: لا تغيير اتجاه VNO مرة واحدة بدأت الاغاروز ترسيخ حيث سيؤدي ذلك إلى فصل الأنسجة من الاغاروز المحيطة بها.

4. الاكليل VNO الأنسجة التقطيع

  1. استخدام ملعقة صغيرة لإزالة كتلة الاغاروز من صحن صغير في غطاء من طبق بتري كبير، والوجه الاغاروز رأسا على عقب مغادرة طرف الذيلية من VNO التي تواجه صعودا.
  2. خفض كتلة في شكل هرمي باستخدام مشرط جراحي (3-4 ملم على الحافة، 8-10 ملم في الأسفل). الحرص على عدم تلف الأنسجة جزءا لا يتجزأ.
  3. استخدام سوبر الغراء لإصلاح كتلة على شكل هرم من وسط لوحة العينة vibratome والانتظار ~ 1 دقيقة للالغراء لتجف تماما.
  4. نقل لوحة عينة لتشريح جهامبر وإعداد VNO الثاني، وفقا لذلك. حافظ على لوحة مع العينة الثانية في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  5. استخدام تهتز مشراح شفرة مع الإعدادات التالية: سمك: 150-200 ميكرون. السرعة: 3.5 او = 0.15 ملم / ثانية؛ تردد: 7.5 او = 75 هرتز. نقل شرائح لبالاكسجين الغرفة حتى استخدامها بعد تفقده لفترة وجيزة شريحة التشكل تحت المجهر تشريح. شرائح يمكن أن تبقى لعدة ساعة.

5. وحيد الخلية تسجيلات الكهربية

  1. للحصول على تسجيلات، استخدم تستقيم المرحلة الثابتة المجهر مجهزة أهداف الغمر بالماء، Dodt أو الأشعة تحت الحمراء التفاضلية التدخل النقيض (IR-DIC)، وبرنامج التحصين الموسع ومضان فضلا عن تبريد لاتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا. للحصول على البيانات، واستخدام مكبر للصوت التصحيح، المشبك، ومرحلة الرأس، AD / DA واجهة المجلس وجهاز كمبيوتر (بما في ذلك برنامج تسجيل).
  2. إعداد المخزون من 10-20 ماصات التصحيح (4-7 MΩ). ماصات سحب من الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج (1.50 مم OD / 0.86 ملم ID) النقيبالجا مجتذب micropipette والنار-البولندية مع microforge.
    ملاحظة: حريق تلميع نصائح ماصة أمر بالغ الأهمية عندما ترميم VSNs صغيرة نوعا ما. وهذا سوف يساعد على منع تمزق غشاء الخلية عند تطبيق الضغط السلبي من أجل الحصول على ختم مقاومة عالية. بعد تلميع افتتاح ماصة ينبغي أن يكون حوالي 1 ميكرون.
  3. حافظ على ماصات في جرة تخزين ماصة لمنع الضرر وتراكم الغبار حتى الاستخدام.
  4. إعداد نظام نضح عن طريق ملء خزانات حل وأنابيب وفقا لتصميم تجريبي.
    ملاحظة: إزالة فقاعات الهواء من الأنابيب تماما لأنها سوف تتدخل بقوة مع التسجيلات الكهربية.
  5. ضبط ضغط لتحقيق ~ 3 تدفق مل / دقيقة.
    ملاحظة: سوف ضغوط عالية تسبب حركة شريحة الأنسجة وكذلك إنهاء التسجيلات الكهربية.
  6. نقل VNO شريحة إلى غرفة التصوير وتحديد موقف شريحة باستخدام مرساة الفولاذ المقاوم للصدأ سلكية مع 0.1 ملم synt سميكةالألياف hetic (الشكل 2B - C).
    ملاحظة: لا تغطي شريحة الأنسجة مع واحد من المواضيع الألياف الاصطناعية وإنما الاغاروز المحيطة شريحة.
  7. غرفة التصوير نقل إلى تسجيل الإعداد وشريحة superfuse مستمر مع S الاوكسيجين 2 في درجة حرارة الغرفة عن طريق تطبيق الحمام.
  8. ضبط الشعرية الشفط لسطح لإيجاد حل شفط بطيئة لتبادل مستمر للحل حمام. ضبط 8 في 1 متعددة برميل "قلم رصاص نضح" أعلاه وعلى مقربة من الجزء غير الحسي للشريحة VNO التي تحتوي على الأوعية الدموية (الشكل 2C، 3A) 50. وسوف يكون من المفيد لترتيب قلم نضح وتسجيل ماصة ليكون التي تواجه شريحة من اتجاهين متعاكسين.
  9. ربط الكهربائي إشارة وحل حمام باستخدام جسر أغار على شكل حرف L (مليئة 150 ملي بوكل).
  10. ملء ماصة التصحيح مع الحل ماصة S 4.
  11. جبل ماصة على المغلفة كلوريد الفضة التصحيح الكهربائي الموصل إلى مرحلة الرأس دون كشط الطلاء ونعلق بحزم.
  12. تطبيق ضغط إيجابي طفيف (حوالي 1 مل على حقنة بلاستيكية 10 مل) إلى ماصة التصحيح قبل دخول الحمام.
  13. انخفاض ماصة في الحمام باستخدام المتلاعبين الجزئي بعيدا بما فيه الكفاية لتكون قادرة على غمر الهدف دون ضرب عليه (الشكل 2D).
  14. مراقبة مقاومة ماصة (R نقطة، بين 4-7 MΩ) باستخدام برنامج الكهربية المتصلة مرحلة الرأس.
    ملاحظة: إذا كان R النقطة هي <4 MΩ طرف الزجاج المكسور. إذا R النقطة هي> 10 MΩ، وعلى الأرجح انسداد طرف ويجب أن يتم استبدال ماصة.
  15. تصور شريحة VNO مع كاميرا CCD باستخدام النقيض تدخل الفرق الأشعة تحت الحمراء الأمثل (DIC) وتحديد FPR-RS3-ط-فينوس معربا عن الخلايا (أو بالمثل الخلايا العصبية المسماة) باستخدام الإضاءة مضانوعامل تصفية مكعب المناسب.
  16. التركيز والفلورسنت الهدف أو الخلايا غير الفلورسنت اعتمادا على التصميم التجريبي.
  17. الاقتراب من خلايا الجسم، واستخدام عجلات اليد لأقصى قدر من الحساسية. بسبب ضغط إيجابي، دنت صغير في غشاء الخلية سوما تصبح مرئية مرة واحدة غيض ماصة على مقربة.
  18. الافراج عن الضغط الايجابي وتطبيق ضغط سلبي طفيف لتمتص في غشاء الخلية من أجل الحصول على ختم مقاومة عالية (1-20 GΩ). تطبيق شفط قصيرة ورقيقة لتعطيل غشاء الخلية وإنشاء تكوين خلية كاملة.
  19. رصد المقاومة وصول باستمرار خلال التجربة.
    ملاحظة: تشمل فقط الخلايا العصبية واظهار المقاومة وصول الصغيرة ومستقرة (≤3٪ من R المدخلات؛ التغيير <20٪ خلال التجربة) في التحليل.

النتائج

للحصول على نظرة ثاقبة الخصائص الفيزيائية الحيوية والفسيولوجية للسكان الخلية المحددة، ونحن أداء شرائح الأنسجة الاكليلية الحادة من الفأرة VNO (الشكل 1-2). بعد التشريح، وشرائح يمكن أن تبقى في الجليد الباردة حل خارج الخلية الاوكسيجين (S...

Discussion

وVNO هو بنية حسي كيميائي التي يكشف semiochemicals. حتى الآن، لا تزال غالبية من المستقبلات الميكعي إلى أن deorphanized كما تم تحديدها فقط بضعة أزواج مستقبلات يجند. من بين هؤلاء، وقد وصفت V1rb2 لتفعيلها على وجه التحديد من قبل الذكور فرمون البول 2-heptanone 30، V2rp5 لتفعيلها من قبل الذكور ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Agarose (low-gelling temperature)PeqLab35-2030
ATP (Mg-ATP)Sigma-AldrichA9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)Sigma-AldrichB9879
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)Sigma-AldrichE3889
GlucoseSigma-AldrichG8270
GTP (Na-GTP)Sigma-Aldrich51120
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333
Potassium hydroxideSigma-Aldrich03564
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sodium hydrogen carbonateSigma-AldrichS5761
Sodium hydroxideSigma-AldrichS8045
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical tools and consumables
Large Petri dish, 90 mmVWRdecapitation, dissection of VNO capsule
Small Petri dish, 35 mmVWRlid for VNO dissection, dish for embedding in agarose
Sharp large surgical scissorFine Science Toolsdecapitation, removal of lower jaw
Strong bone scissorsFine Science Toolscutting incisors
Medium forceps, Dumont tweezers #2Fine Science Toolsremoving skin and palate
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades Fine Science Toolscutting out VNO 
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5Fine Science Toolsdissecting VNO out of cartilaginous capsule
Small stainless steel spatulaFine Science Toolshandling agarose block and tissue slices
Surgical scalpelcutting agarose block into pyramidal shape
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
AmplifierHEKA ElektronikEPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)Science Products
CCD-cameraLeica MicrosystemsDFC360FX
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515Leica MicrosystemsI3
Fluorescence lampLeica MicrosystemsEL6000
Hot plate magnetic stirrerSnijders34532
Microforge NarishigeMF-830
Micromanipulator Device Luigs & NeumannSM-5
Micropipette puller, vertical two-stepNarishigePC-10 
MicroscopeLeica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)Quest Scientific
Objective Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1.00 W
OscilloscopeTektronikTDS 1001B
Osmometer GonotecOsmomat 030
Perfusion system 8-in-1AutoMate Scientific
pH Meter five easyMettler Toledo
Pipette storage jarWorld Precision Instrumentse212
Recording chamber Luigs & NeumannSlice mini chamber
Razor bladesWilkinson Sword GmbHWilkinson Sword Classic
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)custom-made
Stereo microscopeLeica MicrosystemsS4E
Trigger interface HEKA ElektronikTIB-14 S
Vibratome Leica MicrosystemsVT 1000 S
Water bath MemmertWNB 45

References

  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved