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Neuroscience

Analyse Synaptische Modulation von

Published: February 10th, 2017

DOI:

10.3791/55176

1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)
* These authors contributed equally

Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.

Das Nervensystem hat die bemerkenswerte Fähigkeit, auf verschiedene Reize anzupassen und zu reagieren. Diese neuronale Anpassung wird weitgehend durch Plastizität bei der synaptischen Ebene erreicht. Die aktive Zone (AZ) ist der Bereich an der präsynaptischen Membran, die die Freisetzung von Neurotransmittern vermittelt und ist von einer dichten Ansammlung von Gerüstproteine ​​bestehen. AZs von Drosophila melanogaster (Drosophila) Photorezeptoren unterziehen molekularen Remodeling nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht. Somit ist die Höhe der neuronalen Aktivität kann die molekulare Zusammensetzung der AZ neu anordnen und die Regulierung des Funktionsausgang beitragen.

Ausgehend von der Belichtung Set-up Vorbereitung auf die Immunhistochemie, Details dieses Protokoll , wie die Anzahl zu quantifizieren, um die räumliche Verteilung und die Delokalisierung Ebene synaptischer Moleküle an AZs in Drosophila Photorezeptoren. Mit Bildanalyse software, Cluster des GFP-fusionierten AZ Komponente Bruchpilot wurden für jede R8 Photorezeptor (R8) Axonterminal identifiziert. Erkannt Bruchpilot Spots wurden auf einzelne R8 Axone automatisch zugewiesen. Um die Verteilung der Frequenzkanal entlang des Axons zu berechnen, führten wir eine maßgeschneiderte Software-Plugin. Jedes Axon Startpunkt und Endpunkt wurden manuell definiert und die Position jedes Bruchpilot Stelle wurde auf der Verbindungslinie zwischen Start- und Endpunkt projiziert. Neben der Anzahl der Bruchpilot Cluster, quantifiziert wir auch die Delokalisierung Niveau der Bruchpilot-GFP innerhalb der Cluster. Diese Messungen beziehen sich im einzelnen ortsaufgelösten synaptic Dynamik in einem einzigen Neuron unter verschiedenen Umgebungsbedingungen auf Reize.

Die Modulation der synaptischen Funktion trägt zu der bemerkenswerten Fähigkeit des Nervensystems genau zu reagieren oder auf sich ändernde Umweltstimuli anpassen. Die präsynaptischen Vesikelfreisetzung Wahrscheinlichkeit Einstellen ist eine Möglichkeit , 1 synaptischen Stärke zu steuern. Synaptische Vesikel - Freisetzung erfolgt an der aktiven Zone (AZ), einem spezialisierten Bereich der präsynaptischen Membran 2. Die AZ wird durch eine Kassette von spezifischen Proteinen charakterisiert 3, 4. Die meisten Proteine zu AZ Montage beitragen , werden in Nemat....

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Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen beinhalten ausschließlich mit Drosophila funktionieren und nicht zu den Tierschutzgesetze in Deutschland und Japan unterzogen.

1. Lichtbelichtungsbedingungen

  1. Bereiten Sie Fliegen , die sinnlosen-Flippase (sens-FLP) und Bruchpilot-FRT-HALT-FRT-gfp (BRP-FSF-gfp) 15 zur Visualisierung von BRP-GFP in Photorezeptor R8 Neuronen (R8) tragen. Die genomische.......

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Das Facettenauge von Drosophila umfasst ~ 780 Ommatidien, die jeweils acht Typen von Photorezeptoren (R1-8). R7 und R8 Projekt ihre Axone in die zweite Optik Ganglion, der Medulla, wo sie Synapsen in Schichten M6 und M3 bilden jeweils 26. Um die Wirkung von längerer Einwirkung von Licht auf der molekularen Zusammensetzung des Photorezeptors R8 aktiven Zonen zu untersuchen, nutzten wir die STaR Methode 15. Endogene Expression von B.......

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In dieser Studie haben wir gezeigt, wie die Lichtverhältnisse vorzubereiten Fliegen auf eine gleiche Lichtintensität zu belichten. Wir quantifiziert nicht nur die Anzahl der synaptischen puncta Marker könnte aber auch räumlich die Dichte von Synapsen entlang Axone lösen und die Delokalisierung Ebene des Markerproteins in zytoplasmatischen Bereichen zu messen. Diese drei Beurteilungen ermöglichen es uns, die Details der synaptischen Dynamik bei einzelnen Neurons Ebene in verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten........

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Wir danken T. Stürner für hilfreiche Korrekturen, Diskussionen und Kommentare zum Manuskript; SL Zipursky fly Aktien zu liefern; M Schölling zum Durchführen einer Bildverarbeitung. Ein Teil der Bildanalyse wurde bei A. Kakita Labor durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung und JSPS-Stipendien für Forschung unterstützt im Ausland (AS), JSPS-Stipendiaten (SH-S.), Grant-In-Hilfe für die Inbetriebnahme (24800024), auf innovative Bereiche (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE Kernfinanzierung (GT) und DZNE Einrichtung Lichtmikroskopie (CM).

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
VialHightech, JapanMKC-20
PlugThermo Fisher Sciehtific, USAAS-275
Customized transparent rack made of acrylic resin Shin-Shin Corporation, Japana height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step
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Digital light meterCEMDT-1301
Fly padTokken, JapanTK-HA03-S
Petri dish (35 x 10 mm)Greiner Bio-One International, Germany627102
PBS tabletTakara, JapanT900
Triton X-100Wako, Japan160-24751
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20
1.5 ml tubeSarstedt, GermanyA. 152X
Formaldehyde 16%NEM, Japan3152
Pipetman P-200GilsonF123601 
Pipetman P-20GilsonF123600
Pipetman P-2GilsonF144801
anti-chaoptin antibodyDSHB24B10
Alexa568-conjugated anti-mouse antibodyLife TechnologiesA-11031
VECTASHIELD Mounting MediumVector Laboratories, Inc.H-1000
Microscope slide (76 x 26 mm)Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany
Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)Zeiss, Germany474030-9000-000
Industrial MicroscopesOlympus, JapanSZ61-C-SET
Stereo Microscope LightingOlympus, JapanKL 1600 LED
confocal microscopyZeiss, GermanyLSM780
ImarisBitplane, SwitzerlandVersion 7.6.4 or above
MatlabThe MathWorks, Inc., USA
Excel for Mac Microsoft

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