げっ歯類での後根神経節の脊髄および単離の油圧押出

要約

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

要約

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

概要

この方法の全体的な目的は、脊髄を単離するために、ならびにたDRG ^1,2を同定および単離することです。脊髄の水圧押出時に脊椎骨一方を破壊することによって、すなわち 、椎弓切除術により脊髄分離する従来の方法よりも大幅に速い方法であり、この方法は、解剖法³によって引き起こされる組織損傷の危険性を低減し^、4 。 DRGを識別することは困難であろう。正確な同定は、 例えば 、坐骨神経損傷後、組織分析のために非常に重要です。肋骨へのそれらの局在の相対に従ってのDRGに番号を付けることにより、DRGを一貫して識別することができます。

ここで実証された技術により単離された組織は^、ウェスタンブロッティング^5を含む分析の広い範囲に適用することができます6、定量PCR ⁷および免疫組織化学染色^8。

DRGを識別するとき、脊髄セグメントの数は、動物のタイプおよび株^9、10、11と変化することが知られていることを考慮することが重要です。マウスでは、この方法を実行する際の利点は、利用可能な遺伝的に修飾された変異体と比較的低い住宅費の数が多いです。ラットを使用しての利点は、比較的に高い組織の収率であり、神経損傷を伴う場合には、手順はサイズで緩和されます。

プロトコル

全ての動物は、デンマークと欧州の規制に完全に準拠して処理されていました。許可番号：2012-15-2934。

脊髄の油圧押出用シリンジの調製

1. 成体ラットの場合、10 mLの注射器を使用しています。成体マウスの場合は、5 mLの注射器を使用しています。子犬のために、2.5 mLの注射器を使用しています。
2. それは注射器にしっかりと収まるまで、ピペットチップの大端をトリミングすることによって2-200μLピペットのために普遍的に適切な非フィルターピペットチップを調整します。注射器の調整されたピペットチップを置きます。子犬のために、調整されたピペットチップの代わりに23 Gまたは類似の針を使用します。
3. 吸引除去し、氷冷滅菌PBSおよびさらに使用するまで氷上で注射器を残します。

2.安楽死

1. これが不可能な押し出しをレンダリングする脊椎骨の​​障害になるように、頸椎脱臼を実行しないでください。
2. 成体ラット/マウスの場合は、例えばCO ₂やisofluなどのガスを使用して安楽死させますRANE。これらの物質は有害です。ドラフト内で安楽死を実行し、機関のガイドラインに従って物質を取り扱います。 （注意：CO _{2：H280、P410、P403、}イソフルラン：H361d、P260、P281、P280）
   1. げっ歯動物が死んでいることを確認するために、ピンセットで足をつまんで反射が存在しないことを確認してください。大きなはさみを使用して、げっ歯類を刎ねます。子犬のために、断頭により安楽死させます。

脊柱の3分離

1. 髪を制御するために毛皮に水を振りかけます。
2. ハサミを使用して、遠位方向に脊柱に沿って毛皮を開いてカットし、骨盤骨過去の脊柱に沿って両側に切断することにより、脊柱を分離します。ハサミで骨盤骨に遠位脊髄をカットします。
   注：吻側 - 尾側軸は、プロトコルを通して近位 - 遠位軸として示されています。
   1. proximal-を回避するためにハサミを使用して脊柱をトリムこれらのようなほとんどと最も遠位の領域があまりにも成功した脊髄押出にS字型の脊柱をレンダリングすることができます。脊髄が両端に表示されていることを確認してください。脊髄が表示されていない場合、脊髄が見えるようになるまで、ハサミで脊柱をトリム。

脊髄の4油圧押出

1. 氷上で滅菌PBSで満たされたペトリ皿（直径100mm）を配置します。
2. これにより、できるだけ多くの脊柱を矯正、脊柱の屈曲部（最も近位端）に人差し指を適用することによって、脊柱をまっすぐにします。
   1. 椎骨は不可能脊髄押し出しをレンダリング中断されますように子犬のために、背骨を曲げません。
3. 脊柱の最遠位端にピペットチップ（子犬用23 G針、成体マウスのための代わりに18 G針）を挿入します。正しく挿入した場合、先端が脊髄空洞内に安定化されます。
4. 脊柱は、可能な限りまっすぐにされていることを確認してください。安定した圧力を適用し、氷上のペトリ皿に脊髄を押し出します。脊髄がさらに取り扱いまで、PBS中でそれを維持することによって氷の上に湿った保たれていることを確認してください。

図1： 代表的脊髄。油圧で脊髄を押し出さ。成体ラット、成体マウス、マウスの子犬：左から右。ボックスでマークされた腰椎拡大。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

後根神経節の5識別（DRG）を切り出し、

1. はさみを使用して2つの等しい縦の部分で脊柱を分割し、顕微鏡下で分割脊柱を配置します。
2. によってT13の椎骨セグメントを特定します近くの肋間神経で肋骨を混同しないように注意を払って脊柱上の最遠位肋骨の付着部位の位置を特定します。最遠位肋骨はT13の椎骨セグメントの近位部に装着され、T13 DRGは、椎骨T13にし、近位椎骨L1に遠位に位置しています。
3. 遠位方向に付随したDRGを識別します。成体ラットの場合、付随DRGを明確に見える背側と腹側の根の白い表示されます。成体マウスの場合、付随DRGを明確に見える背側と腹側の根の白い表示されます。子犬のために、付随DRGをクリア球を表示されます。

図2：脊髄の押出後の脊柱内のDRGの同定。脊柱は、矢印で示すようのDRGの可視化を可能に分割されています。成体ラットとマウスの子犬によって例示。 REF = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

DRGの6の単離

1. 特定のDRGに従って番号ペトリ皿（直径30mm）を、例えば 、L3、L4、L5、単離することができます。氷冷滅菌PBSでペトリ皿を記入し、氷の上に置きます。
2. マイクロはさみを使用して、背側とのDRGにダメージを与える避けながら、それらを解放するためにできる限りのDRGに近い腹側根をカット。
3. 閉じたピンセットの先端で、軽くのDRGをかき出すと、対応する番号のペトリ皿に移します。

図3：代表単離したDRG。成体ラット、成体マウス、マウスの子犬：左から右。"_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

さらなる分析のための組織の7.処理

1. ウエスタンブロット法
   1. 脊髄腰膨大例えば 、関心の組織領域を分離します。必要に応じて、同側および対側の側面に脊髄を分離し、さらに背側と腹側の角へ。
   2. このような氷の上の適切な酵素阻害剤を含むTNE溶解緩衝液（10mMトリス塩基、150mMのNaCl、1mMのEDTA、二重蒸留H ₂ O中1％NP40）などの溶解緩衝液中で組織を置きます。
   3. 機械的粉砕乳棒を用いて氷上で約30秒のための組織をホモジナイズします。
   4. 4℃で16,000×gで15分間遠心分離し、標準的なプロトコル^5、6に従って、さらなる処理のために上清を使用したり、さらに使用するまで-20℃で上清を保ちます。
2. RNA分析
   1. 目的の組織を分離します。
   2. すぐにストレージのためのRNAを安定化するために、RNAの安定化溶液中の組織を置きます。
   3. 標準プロトコル⁷に記載^の RNAを分離します。
   4. RNAをcDNAに変換し、標準的なプロトコル⁷に従って定量PCRを行います。
3. 免疫組織化学
   1. （脊髄に適用）新鮮凍結組織の場合：
      1. 粉大さじ2杯に相当する量にドライアイスキューブを粉砕してドライアイス粉末を準備します。布でドライアイスキューブをカバーし、ハンマーを使用してキューブを粉砕。ドライアイスキューブの層の上に銀箔（約5cm×5センチ）を配置し、ドライアイス粉末と銀箔をカバーしています。
      2. ピンセットを用いて、ドライアイス粉末にさらなる分析のために選択された脊髄領域を配置し、それは、スナップ凍結し、クライオチューブに脊髄を転送してみましょう。すべての回で、ドライアイス上でそれを維持するか、または私達を促進するまで-80℃で保管してください電子。
      3. クライオスタット（-20℃）に脊髄を転送します。必要な場合は、クライオスタット内部の脊髄をトリミング。試料ディスクにアタッチするために、クライオスタット内部の材料を埋め込むに脊髄を置きます。
      4. 例えば 5μmで、所望の厚さで脊髄を切断し、ガラス板上に集まります。より良い結合のための組織収集に直前に指でガラス板を加熱します。さらに使用するまで-80℃で凍結チューブ中の残った組織を保ちます。
      5. 定着後の準備ができるまで、クライオスタット内部のガラス板上のセクションを残します。
      6. 室温で10分間、4％PFAに浸漬することによってセクションをポスト修正。
      7. 標準プロトコル⁸に従って染色実行します。
   2. （脊髄およびDRGをに適用）切片凍結のために固定された組織
      1. 4％PFA（脊髄のための2時間、マウスのDRGのための1.5時間およびラットのDRGのため4時間）で脊髄とのDRGを修正しました。4°C（水平位置にある場所脊髄が曲がった位置に固定するのを防ぐため）。
      2. 4℃で一晩w / vスクロース25％に組織を転送します。組織は、さらなる使用まで4℃で微生物汚染を防止するために、10％のアジ化ナトリウムを数滴を補充w / vスクロース25％に格納することができます。必要な場合は、唯一のシリコーンボードまたは類似の上に腰膨大を補うために脊髄をトリミング。
      3. ペーパータオルの先端を使用して、組織から過剰なスクロース溶液を吸引します。
      4. 材料を埋め込むと低温の金型半埋めます。このような閉じたピンセットなどのツールでクライオ金型の側面に気泡を押してください。
      5. ピンセットを使って埋め込む材料に組織を置き、所望の組織の向きを確認してください。
      6. 材料を埋め込むで完全に凍結型を充填し、遠く（閉じたピンセットを用いて、 例えば ）可能な限り組織から任意の気泡を押し出します。
      7. ペトリ皿（100ミリメートルを埋めます2-メチルブタンと直径）インチこの物質は有害です。ドラフト内で、このステップを実行し、機関のガイドラインに従って物質を処理する（注意：H224、H304、H336、H411、P210、P280、P273、P301、P331、P304 / P340、P309 / P310）。
      8. ドライアイスの層の上にペトリ皿を置き、ペトリ皿に2ドライアイスキューブを追加します。ペトリ皿にクライオ金型を置き、埋め込む物質が完全にフリーズすることができます。
      9. さらなる処理までパラフィルムで包んですべての回で、または-80℃のドライアイス上包埋組織を保管してください。
      10. クライオスタット（-20°C）で所望の厚さに組織、 例えば 5μmでカットします。
      11. 標準プロトコル⁸に従って染色実行します。
   3. （脊髄およびDRGをに適用）パラフィン包埋のために固定された組織
      1. 4°C（場所脊髄で4％PFA（脊髄のための2時間、マウスのDRGのための1.5時間およびラットのDRGのため4時間）で脊髄とのDRGを修正しました。水平に）曲がった位置に固定するのを防止します。
      2. 4℃で一晩w / vスクロース25％に組織を転送します。組織は、さらなる使用まで4℃で微生物汚染を防止するために、10％のアジ化ナトリウムを数滴を補充w / vスクロース25％に格納することができます。
      3. 脊髄腰膨大例えば 、関心の組織領域を分離します。
      4. パラフィンで包埋モールドを半埋めます。
      5. 少しパラフィンを硬化させるために埋め込み機の冷却領域にそれを置くことによって埋め込むモールド簡単にクールダウン。これは、良好な組織の位置決めを可能にします。
      6. 埋め込み型内の所望の方向に組織を置きます。パラフィンで包埋型を記入し、直ちに冷却します。
      7. それは完全に硬化と埋め込み型から組織を含むパラフィンブロックを削除できるように、4℃で一晩パラフィン含有の埋め込み型を置きます。
      8. Oセクションをカット所望の厚さ、 例えば 5ミクロンでミクロトームナ。
      9. 標準プロトコル⁸に従って染色実行します。

結果

油圧で押し出された脊髄は、図1に示す滑らかな損傷を受けていない面が表示されます。腰部拡大が容易図1の箱入り脊髄の肥厚領域として識別することができます。脊髄の背側と腹側の側面は、形態に応じて目で確認することができます。 図1では、腹側は、脊髄全体に沿って明確な正中線によって同定、視聴者に直面しています。脊髄に沿った2つの広いラインは、背側の識別を可能にします。最遠位端で、馬尾は時々成体ラット及び成体マウスに付着したままであってもよいです。

脊柱、 図2に位置しながら、個々のDRGを唯一同定することができます。隔離、 図3に続いて、個々のDRGを外観によって識別することはできません。必要に応じて、それゆえあります明確に分離時に分離しておくことが重要。ステップ7.3において概説し、 図4に示すように分離した後に、脊髄およびDRGを処理して染色することができます。 図4aは、ニューロンとその周囲の衛星グリア細胞がはっきりと見えるDRGセクションの免疫組織化学染色を示しています。 DRGを正しく識別することにより、損傷したニューロンの細胞体に、並びにそれらの周囲の衛星グリア細胞の坐骨神経損傷の効果を分析することが可能です。 図4bは、セクションの滑らかなエッジに反映されるように組織が無傷である油圧で押し出された脊髄のニッスル染色を示します。

図4：代表組織切片。 。 DRGセクションの免疫組織化学染色。 B。ニッスル染色した切断面油圧で押し出された脊髄のn個。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

脊柱が乱された場合、頚椎脱臼により、例えば 、脊髄は、押出中に分割されます。脊髄を押し出すことができない場合、脊柱は両端でわずかにトリミングすることができ、押出試行を繰り返すことができます。ケースで脊髄全体がすなわち子宮頸部の拡大だけでなく、腰膨大からなる、さらなる分析のために必要とされ、脊柱は、ほんの少しだけトリミングする必要があります。唯一の腰膨大をさらなる分析のために必要とされている場合は、脊髄を本プロトコルに従ってトリミングされるべきです。脊柱は、押し出しを容易にするために指先を使ってまっすぐにする必要があります。

プロトコルは、すべての年齢のげっ歯類に適用可能であり、ここで成体マウス（8週）、マウスの仔（5日間）および成体ラット（10週間）が例示されます。動物のタイプおよび株に依存して、胸部および腰部セクションの数は^、9を変えることができます ^10、11。解析対象とするタンパク質に応じて、大人の齧歯類は、前安楽死への酵素阻害ソリューションで灌流することができます。片側神経損傷を伴う実験を行う場合、脊髄はすぐに押出後に超微細ピンセットを用いて、同側と反対側の側面に分割することができます。さらに、各側面は、背側と腹側とに分割することができます。組織は、その後さらなる分析、 例えば、ウェスタンブロッティングのために処理することができます。

これは、脊髄非可撓性をレンダリングし、脊髄油圧押し出しを防止するような先行脊髄押出PFAとTranscardial灌流固定は、避けるべきです。油圧脊髄押出は、後根をはがすます。添付の背側根が必要な実験のために、椎弓切除術が推奨されます。また、脊髄髄膜は、標準的椎弓切除することによって回避することができる油圧押し出し、によって失われます 3。

脊髄とDRGの分離の水圧押出し代わり氷冷PBSの酸素人工脳脊髄液（ACSF）を用いて実施することができます。 ACSFの使用は、その後の電気生理学的記録^12、13の場合には特に重要である優れた生理的環境において、単離された組織の保存を可能にします。 ACSFの代わりに、一次DRG培養物¹⁴の生成のためには1g / Lのグルコースを含有するPBSであってもよいです。

脊髄の水圧押出しは、組織処理時間を短縮し、したがってタンパク質の損傷の危険性を減少させる、椎弓切除術により脊髄分離する従来の方法よりも大幅に速い方法です。固定液で灌流前切開中および最終的な除去の間に組織損傷の危険性を減少させることができる椎弓切除術により脊髄を単離します脊柱から脊髄。しかし、組織の固定は、例えば、ウェスタンブロットなどの分析への適用を排除します。油圧押出利回り分析の広い範囲に適した構造的損傷を受けていない組織^3。

DRGの一貫性の識別が困難な場合があります。しかし、これは、 例えば 、坐骨神経損傷後、組織分析のために不可欠です。肋骨へのそれらの局在の相対に従ってのDRGに番号を付けることにより、DRGを一貫して識別することができます。 DRGの脊髄組織の染色ならびにプロトコルステップ7で概説図示組織治療変形を実行することによって最適化することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm	F.S.C. (Fine Science Tools)	# 14084-08	For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used
Centrifuge	Eppendorf	# 5427 R	For centrifugation of homogenized tissue
Cryostat microtome	Leica Biosystems	# CM 3050 S	For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used
Forceps, Dumont, # 3	F.S.C. (Fine Science Tools)	# 11231-30	For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used
Forceps, Dumont, # 5	F.S.C. (Fine Science Tools)	# 11252-20	For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %	Abbott	# 002185	For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic
Iso-pentane GPR rectapur	VWR chemicals	# 24872.298	For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic
Microtome	Leica Biosystems	# RM 2155	For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used
Paraffin wax pellets	Sigma-Aldrich	# 76243	For paraffin embedding; Other manufacturer may be used
Paraffin tissue embedding station	Leica Biosystems	# EG1160	For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used
Pellet pestel, motor cordless	Sigma-Aldrich	# Z359971-1EA	For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used
Petri dish, 35 mm	Thermo Fischer Scientific	# 121V	For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used
Petri dish, 100 mm	Sigma-Aldrich	# P7741	For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used
Phosphatase inhibitor, Phosstop	Sigma-Aldrich	# 04906845001	Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used
Pipette tip, 1-200 μl, no filter	Sarstedt	# 70.1189.105	For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used
Protease inhibitor, Complete	Sigma-Aldrich	# 05892791001	Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used
RNAlater solution	Sigma-Aldrich	# R0901	For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used
Rneasy Protect Mini KiT	Qiagen	# 74124	For RNA isolation; Other manufacturer may be used
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11	Swann-Morton	# REF0203	For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge	Bochem	# 4070	For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used
Scissors, 130 mm cutting edge	Hounisen	# 1902.0130	For isolation of spinal cord (adult rat)
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge	F.S.C. (Fine Science Tools)	# 15009-08	For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used
Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml	Terumo	# SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1	For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x	Leica	# 10446370	Other manufacturer/type may be used
Sterile PBS	GIBCO	# 10010-015	For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm	Terumo Neolus	# NN-2325R	For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm	Terumo Neolus	# NN-1838S	Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used
Tissue-Tek	Sakura	# 4583	Tssue embedding material for later cryosectionning
TNE-lysis buffer	VWR chemicals	# 10128-582	For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols