تحليل الآلي تقلص الإنسان المهندسة القلب الأنسجة للفحص القلب سلامة الأدوية

Summary

هنا، نقدم لك مجموعة من جيل البشرية هندسة أنسجة القلب من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات (hiPSC) -derived العضلية. نقدم طريقة لتحليل قوة التقلص وتغيير المثالي لنمط تقلص من قناة- herg قناة المانع E-4031. يظهر هذا الأسلوب مستوى عال من المتانة وصلاحيتها للفحص المخدرات القلب.

Abstract

يصف هندسة الأنسجة القلبية التقنيات لتشكل ثلاثة الأنسجة المهندسة الأبعاد توليد القوة. لتنفيذ هذه الإجراءات في البحوث الأساسية وتطوير العقاقير قبل السريرية، فمن المهم وضع بروتوكولات لتوليد وتحليل الآلي في ظل ظروف موحدة. هنا، نقدم تقنية لتوليد أنسجة القلب مهندسة (EHT) من العضلية من مختلف الأنواع (الجرذان والفئران والبشرية). وتعتمد هذه التقنية على التجميع من الليفين هلام يحتوي على العضلية فصل بين polydimethylsiloxane مرن (PDMS) المشاركات في شكل 24-جيدا. يشكل ثلاثي الأبعاد، EHTs توليد قوة في غضون أسبوعين بعد الصب. يسمح هذا الإجراء لتوليد عدة مئات من EHTs في الأسبوع، ويقتصر من الناحية الفنية إلا من خلال توافر العضلية (0،4-1،0 × 10 ⁶ / EHT). يتم تقييم تقلصات العضلات متقلص ضد تزايد المقاومة في غرفة الحضانة تعديل مع ميكانالتعشيق كال ل24 لوحات جيدا وكاميرا وضعت على رأس هذه القاعة. يتحكم البرمجيات انتقلت الكاميرا على نظام محور XYZ لكل EHT. تم الكشف عن تقلصات EHT بواسطة خوارزمية التعرف على الرقم الآلي، ويتم احتساب القوة على أساس تقصير من EHT والميل مرونة والهندسة وظائف PDMS. يسمح هذا الإجراء للتحليل الآلي للارتفاع أعداد EHT في ظل ظروف موحدة ومعقمة. كشف موثوق بها من آثار المخدرات على انكماش cardiomyocyte هو أمر حاسم لتطوير الأدوية القلبية والصيدلة السلامة. علينا أن نبرهن، مع مثال على قناة- herg قناة المانع E-4031، أن النظام EHT البشري يتطابق الردود المخدرات على حركية انقباض القلب البشري، مشيرا إلى أن يكون أداة واعدة لفحص القلب سلامة الدواء.

Introduction

وقد أدت الآثار الجانبية القلبية مثل متلازمة QT الطويلة التي يسببها الدواء لسحب السوق خلال السنوات الماضية. وتشير الإحصاءات إلى أن حوالي 45٪ من جميع عمليات السحب ومن المقرر أن الآثار غير المرغوب فيها على نظام القلب والأوعية الدموية ^1. هذا الفشل المخدرات بعد العملية التنموية مكلفة والموافقة هو السيناريو الأسوأ لشركات الأدوية. لذا تركز إدارات البحوث والتطوير في مجال الكشف عن هذه الآثار غير المرغوب فيها القلب والأوعية الدموية في وقت مبكر. لالمخاوف الاقتصادية والأخلاقية، والجهود المبذولة للحد من التجارب على الحيوانات واستبدالها فحوصات في المختبر فحص جديدة جارية.

Protocol

ملاحظة: تصف الخطوات التالية بروتوكول زراعة الخلايا. الرجاء أداء تحت ظروف معقمة واستخدام وسائل الاعلام قبل تحسنت.

1. القلب تمايز hiPSC

1. زراعة hiPSC

Discussion

تقدم المهندسة أنسجة القلب خيار قيمة إلى مربع أداة للبحوث القلب والأوعية الدموية. وقد أثبتت EHTs في شكل 24-جيدا قيمة لنمذجة مرض ^{8، 14،} وفحص سلامة الدواء ^{7، 8، 10، 11،}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075