Automatiseret Sammentrækning Analyse af humant Engineered Heart Væv til Cardiac Drug Safety Screening

Summary

Her viser vi genereringen af ​​human manipuleret hjertevæv fra inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) afledt cardiomyocytter. Vi præsenterer en metode til at analysere kontraktionskraft og eksemplarisk ændring af sammentrækning mønster af hERG kanal inhibitor E-4031. Denne metode viser høj grad af robusthed og egnethed til hjerte- lægemiddelscreening.

Abstract

Hjertevæv engineering beskriver teknikker til at udgøre tredimensionelle kraftgenererende manipuleret væv. Med henblik på gennemførelsen af ​​disse procedurer i grundforskning og præklinisk lægemiddeludvikling, er det vigtigt at udvikle protokoller for automatiseret generering og analyse under standardiserede forhold. Her præsenteres en teknik til at generere manipuleret hjertevæv (EHT) fra cardiomyocytter af forskellige arter (rotte, mus, menneske). Teknikken beror på konstruktionen af ​​en fibrin-gel indeholdende dissocierede cardiomyocytter mellem elastisk polydimethylsiloxan (PDMS) stillinger i en 24-brønds format. Tre-dimensionelle, kraftgenererende EHTs udgør inden for to uger efter støbning. Denne procedure giver mulighed for generering af flere hundrede EHTs om ugen og er teknisk kun begrænset af tilgængeligheden af cardiomyocytter (0,4-1,0 x 10 ⁶ / EHT). Evaluering af auxotonic muskelsammentrækninger udføres i en modificeret rugekammeret med en mechanical interlock i 24-brønds plader og et kamera placeret på toppen af ​​dette kammer. En software styrer et kamera flyttede et XYZ akse system til hver EHT. EHT kontraktioner detekteres ved en automatiseret figur anerkendelse algoritme, og kraft er beregnet baseret på afkortning af EHT og det elastiske tilbøjelighed og geometrien af ​​PDMS stillinger. Denne procedure giver mulighed for automatiseret analyse af høje antal af EHT under standardiserede og sterile betingelser. Den pålidelig detektering af narkotika effekter på cardiomyocyte sammentrækning er afgørende for hjerte-lægemiddeludvikling og sikkerhed farmakologi. Vi viser, med eksemplet med hERG kanal inhibitor E-4031, at det humane EHT systemet replikater drug svar på sammentrækning kinetik det menneskelige hjerte, hvilket indikerer, at det er et lovende redskab til hjerte- lægemiddelsikkerhed screening.

Introduction

Hjertesygdomme bivirkninger såsom narkotika-induceret langt QT-syndrom har ført til tilbagekøb fra markedet i løbet af de seneste år. Statistikker viser, at omkring 45% af alle udbetalinger skyldes uønskede virkninger på det kardiovaskulære system ^1. Dette stof fiasko efter den dyre udviklingsmæssige proces og godkendelse er det værst tænkelige scenario for farmaceutiske virksomheder. Forsknings- og udviklingsafdelinger derfor fokus på at påvisning af sådanne uønskede kardiovaskulære virkninger tidligt. Af økonomiske og etiske overvejelser, bestræbelser på at reducere dyreforsøg og erstatte dem med nye in vitro screening-assays er i g....

Protocol

BEMÆRK: De følgende trin beskriver en cellekultur protokol. Zoom udføre under sterile betingelser og anvende forvarmet medier.

1. Cardiac Differentiering af hiPSC

1. Dyrk den hiPSC
   1. Coat plader med 6 brønde (1 ml / brønd) eller T75-kolber (7 ml / kolbe) med reduceret vækstfaktor basalmembranmatrix (fx geltrex, 1: 200; se tabel af materialer) fortyndet i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) til 30 minutter ved 37 ° C. Forberede FTDA stof .......

Discussion

Udviklet hjerte væv giver en værdifuld mulighed for at værktøjskasse af hjerte-kar-forskning. EHTs i 24-brønds format har vist værdifulde til sygdom modellering ^{8, 14,} lægemiddelsikkerhed screening ^{7, 8, 10, 11, 15,} eller basisk kardiovaskulær forskning ^16, <.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075