Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Hier tonen we de generering van humane gemanipuleerde hartweefsel van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een methode om contractiekracht en voorbeeldige verandering van contractie patroon geanalyseerd door hERG kanaal remmer E-4031. Deze werkwijze vertoont een hoge mate van robuustheid en geschiktheid voor cardiale geneesmiddelscreening.

Abstract

Hartweefsel techniek beschreven technieken driedimensionale kracht opwekkende gemanipuleerde weefsels vormen. Voor de uitvoering van deze procedures in fundamenteel onderzoek en preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen, is het belangrijk om protocollen voor automatisch genereren en analyses te ontwikkelen onder gestandaardiseerde omstandigheden. Hier presenteren we een techniek om Engineered hartweefsel (EHT) van cardiomyocyten van verschillende species (rat, muis, mens) te genereren. De techniek berust op de montage van een fibrine-gel die gedissocieerd cardiomyocyten tussen elastische polydimethylsiloxaan (PDMS) berichten in een 24 putjes format. Driedimensionale, kracht opwekkende EHTs vormen binnen twee weken na het gieten. Deze procedure maakt het mogelijk om het genereren van enkele honderden EHTs per week en is technisch alleen beperkt door de beschikbaarheid van hartspiercellen (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluatie van auxotonic spiercontracties wordt uitgevoerd in een gewijzigde incubatiekamer met een mechanical interlock 24-wells platen en een camera bovenop deze kamer. Een software bestuurt een camera bewogen op een XYZ-assenstelsel elke EHT. EHT contracties gedetecteerd worden door een geautomatiseerd figuur algoritme en kracht berekend op basis van verkorting van de EHT en elastische neiging en geometrie van de PDMS posten. Deze procedure maakt het mogelijk voor automatische analyse van grote aantallen EHT onder gestandaardiseerde en steriele omstandigheden. De betrouwbare detectie van effecten van geneesmiddelen op cardiomyociet samentrekking is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van het hart van geneesmiddelen en veiligheid farmacologie. We demonstreren het voorbeeld van het hERG kanaal remmer E-4031, dat het menselijke EHT systeem repliceert drug reacties op contractie kinetiek van het menselijk hart, wat aangeeft dat een veelbelovend voor cardiale drugveiligheid screening.

Introduction

Cardiale bijwerkingen zoals de door drugs veroorzaakte lange QT-syndroom hebben geleid tot de markt nemen van de afgelopen jaren. Statistieken tonen aan dat ongeveer 45% van alle opnames zijn te wijten aan ongewenste effecten op het cardiovasculaire systeem 1. Dit medicijn niet na de dure ontwikkelingsproces en goedkeuring is het worst-case scenario voor farmaceutische bedrijven. Onderzoek en ontwikkeling afdelingen daarom richten op het opsporen van dergelijke ongewenste cardiovasculaire effecten vroeg op. Voor economische en ethische bezwaren, de inspanningen om dierproeven te verminderen en te vervangen door nieuwe in vitro screeni....

Protocol

OPMERKING: De volgende stappen beschrijven een celcultuur protocol. Gelieve te presteren onder steriele omstandigheden en het gebruik van voorverwarmde media.

1. Cardiac Differentiatie van iPSC

  1. Cultiveren van de iPSC
    1. Coat 6 putjes (1 ml / putje) of T75-kolven (7 ml / kolf) waarvan de groeifactor basaalmembraanmatrix (bijv geltrex, 1: 200; zie tabel materiaalkosten) verdund in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) voor 30 min bij 37 ° .......

Representative Results

Cardiale differentiatie en Bereiding van EHT

IPSC werden uitgebreid op verkorte groeifactor basaalmembraanmatrix, gedissocieerd met EDTA en embryoid lichamen (EB's), gevormd in spinner kolven overnacht. Na mesodermale inductie gedurende drie dagen werd cardiale differentiatie gestart met het Wnt-remmer. Na ~ 17 dagen differentiatieprotocol, sloegen EBS gedissocieerd tot afzonderlijke cellen met collagenase type II (fi.......

Discussion

Engineered hartweefsel biedt een waardevolle optie om de gereedschapskist van het cardiovasculair onderzoek. EHTs in 24 putjes zijn waardevol gebleken voor ziektemodel 8, 14, drugveiligheid screenen 7, 8, 10, 11, 15, of basische cardiovasculair onderzoek 16,

Acknowledgements

De auteurs zijn dankbaar Alessandra Moretti en Dennis Schade voor hun vriendelijke bijdrage van het materiaal. Wij erkennen de grote steun van de iPS en EHT werkgroep bij de afdeling Experimentele Farmacologie en Toxicologie van het UKE. Het werk van de auteurs wordt ondersteund door subsidies van de DZHK (German Center for Cardiovascular Research) en het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), de Duitse Research Foundation (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), British National Center for the Replacement Verfijning en Vermindering van Dieren in Onderzoek (NC3Rs BARST-IT verlenen 35.911-259.146), de British Heart Foundation RM / 13/30157, de European Resear....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EHT analysis intrumentEHT Technologies GmbHA0001Software is included
EHT PDMS rackEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE spacerEHT Technologies GmbHC0002
EHT electrodeEHT Technologies GmbHP0001
EHT pacing adapter/cableEHT Technologies GmbHP0002
24-well-plateNunc144530
6 well-cell culture plateNunc140675
15 ml falcon tube, graduated Sarstedt62,554,502
Cell scraperSarstedt831,830
Spinner flaskIntegra182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask Sarstedt 831,812,002
V-shaped sedimentation rack Custom made at UKE Hamburgna
10× DMEMGibco52100
1-Thioglycerol Sigma AldrichM6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin-A R&D systems338-AC
Agarose Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insulin Gibco17504-044
BMP-4R&D systems314-BP
Collagenase II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, type V (from bovine spleen)Sigma D8764
Dorsomorphin abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Fetal calf serumGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrinogen (bovine)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
Horse serumLife technologies26050088
Human serum albumin Biological Industries05-720-1B
Insulin, humanSigma AldrichI9278
L-GlutaminGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-ToluenesulfonamideTCIB3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Penicillin/StreptomycinGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
Polyvinyl alcohol Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Sodium seleniteSigma AldrichS5261
TGFß1Peprotech100-21
ThrombinSigma AldrichT7513
Transferrin Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCCustom made at UKE hamburgna
iCell cardiomyocytes kitCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kitPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kitAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytesTakara Bio USA, Inc.Y10075

References

  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?. Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S.

This article has been published

Video Coming Soon

We use cookies to enhance your experience on our website.

By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.

Learn More