A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Hier tonen we de generering van humane gemanipuleerde hartweefsel van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een methode om contractiekracht en voorbeeldige verandering van contractie patroon geanalyseerd door hERG kanaal remmer E-4031. Deze werkwijze vertoont een hoge mate van robuustheid en geschiktheid voor cardiale geneesmiddelscreening.
Hartweefsel techniek beschreven technieken driedimensionale kracht opwekkende gemanipuleerde weefsels vormen. Voor de uitvoering van deze procedures in fundamenteel onderzoek en preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen, is het belangrijk om protocollen voor automatisch genereren en analyses te ontwikkelen onder gestandaardiseerde omstandigheden. Hier presenteren we een techniek om Engineered hartweefsel (EHT) van cardiomyocyten van verschillende species (rat, muis, mens) te genereren. De techniek berust op de montage van een fibrine-gel die gedissocieerd cardiomyocyten tussen elastische polydimethylsiloxaan (PDMS) berichten in een 24 putjes format. Driedimensionale, kracht opwekkende EHTs vormen binnen twee weken na het gieten. Deze procedure maakt het mogelijk om het genereren van enkele honderden EHTs per week en is technisch alleen beperkt door de beschikbaarheid van hartspiercellen (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluatie van auxotonic spiercontracties wordt uitgevoerd in een gewijzigde incubatiekamer met een mechanical interlock 24-wells platen en een camera bovenop deze kamer. Een software bestuurt een camera bewogen op een XYZ-assenstelsel elke EHT. EHT contracties gedetecteerd worden door een geautomatiseerd figuur algoritme en kracht berekend op basis van verkorting van de EHT en elastische neiging en geometrie van de PDMS posten. Deze procedure maakt het mogelijk voor automatische analyse van grote aantallen EHT onder gestandaardiseerde en steriele omstandigheden. De betrouwbare detectie van effecten van geneesmiddelen op cardiomyociet samentrekking is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van het hart van geneesmiddelen en veiligheid farmacologie. We demonstreren het voorbeeld van het hERG kanaal remmer E-4031, dat het menselijke EHT systeem repliceert drug reacties op contractie kinetiek van het menselijk hart, wat aangeeft dat een veelbelovend voor cardiale drugveiligheid screening.
Cardiale bijwerkingen zoals de door drugs veroorzaakte lange QT-syndroom hebben geleid tot de markt nemen van de afgelopen jaren. Statistieken tonen aan dat ongeveer 45% van alle opnames zijn te wijten aan ongewenste effecten op het cardiovasculaire systeem 1. Dit medicijn niet na de dure ontwikkelingsproces en goedkeuring is het worst-case scenario voor farmaceutische bedrijven. Onderzoek en ontwikkeling afdelingen daarom richten op het opsporen van dergelijke ongewenste cardiovasculaire effecten vroeg op. Voor economische en ethische bezwaren, de inspanningen om dierproeven te verminderen en te vervangen door nieuwe in vitro screeni....
OPMERKING: De volgende stappen beschrijven een celcultuur protocol. Gelieve te presteren onder steriele omstandigheden en het gebruik van voorverwarmde media.
1. Cardiac Differentiatie van iPSC
Cardiale differentiatie en Bereiding van EHT
IPSC werden uitgebreid op verkorte groeifactor basaalmembraanmatrix, gedissocieerd met EDTA en embryoid lichamen (EB's), gevormd in spinner kolven overnacht. Na mesodermale inductie gedurende drie dagen werd cardiale differentiatie gestart met het Wnt-remmer. Na ~ 17 dagen differentiatieprotocol, sloegen EBS gedissocieerd tot afzonderlijke cellen met collagenase type II (fi.......
Engineered hartweefsel biedt een waardevolle optie om de gereedschapskist van het cardiovasculair onderzoek. EHTs in 24 putjes zijn waardevol gebleken voor ziektemodel 8, 14, drugveiligheid screenen 7, 8, 10, 11, 15, of basische cardiovasculair onderzoek 16,
De auteurs zijn dankbaar Alessandra Moretti en Dennis Schade voor hun vriendelijke bijdrage van het materiaal. Wij erkennen de grote steun van de iPS en EHT werkgroep bij de afdeling Experimentele Farmacologie en Toxicologie van het UKE. Het werk van de auteurs wordt ondersteund door subsidies van de DZHK (German Center for Cardiovascular Research) en het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), de Duitse Research Foundation (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), British National Center for the Replacement Verfijning en Vermindering van Dieren in Onderzoek (NC3Rs BARST-IT verlenen 35.911-259.146), de British Heart Foundation RM / 13/30157, de European Resear....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
24-well-plate | Nunc | 144530 | |
6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
15 ml falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
Spinner flask | Integra | 182 101 | |
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
10× DMEM | Gibco | 52100 | |
1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
DMEM | Biochrom | F0415 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
EDTA | Roth | 8043.2 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
HEPES | Roth | 9105.4 | |
Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.