ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב

Summary

כאן, אנו מציגים את הדור של רקמת לב מהונדסים אנושי מתאי גזע מושרים (hiPSC) -derived cardiomyocytes. אנו מציגים שיטה לנתח בכוח התכווצות ושינוי למופת של דפוס כיווץ ידי מעכב ערוץ hERG E-4031. שיטה זו מציגה רמה גבוהה של חוסן ויכולת התאמת הקרנת סמי לב.

Abstract

הנדסת רקמות לב מתארת ​​טכניקות להוות שלוש רקמות מהונדסות מניב כוח ממדים. לשם יישום הנהלים אלה במחקר בסיסי ופיתוח תרופות פרה-קליני, חשוב לפתח פרוטוקולים עבור דור אוטומטי וניתוחים בתנאים סטנדרטיים. כאן, אנו מציגים טכניקה ליצירת רקמת לב Engineered (EHT) מ cardiomyocytes של מינים שונים (חולדה, עכבר, אדם). הטכניקה מתבססת על מכלול של א-ג'ל הפיברין המכיל cardiomyocytes ניתק בין polydimethylsiloxane אלסטי (PDMS) הודעות בפורמט 24-היטב. שלוש ממדי, מניב כוח EHTs מהווה בתוך שבועות אחרי הליהוק. הליך זה מאפשר לדור של כמה מאות EHTs בשבוע מוגבל מבחינה טכנית רק על ידי הזמינות של שריר הלב (0.4-1.0 x 10 ⁶ / EHT). הערכת התכווצויות שרירי auxotonic מתבצעת בתא דגירה שונה עם mechanמשתלב iCal עבור צלחות 24-היטב ומצלמה ממוקמת על גבי תא זה. תוכנה שולטת במצלמה עבר על מערכת צירים XYZ לכל EHT. התכווצויות EHT מזוהות על ידי אלגוריתם זיהוי דמות אוטומטי, וכוח מחושב על בסיס קיצור של EHT ואת הנטייה אלסטי וגיאומטריה של הודעות PDMS. הליך זה מאפשר ניתוח אוטומטי של מספרים גבוהים של EHT בתנאים סטנדרטיים סטרילי. זיהוי האמין של שפעות תרופה על התכווצות cardiomyocyte הוא קריטי להתפתחות ופרמקולוגיה בטיחות תרופת לב. אנו מדגימים, עם הדוגמא של E-4031 מעכב ערוץ hERG, שמערכת EHT האנושית משכפלת תגובות תרופה על קינטיקה התכווצות של הלב האנושי, המציין שזה יהיה כלי מבטיח עבור הקרנת בטיחות תרופת לב.

Introduction

תופעות לוואי לב כגון תסמונת QT-induced סמים הארוכה הובילו משייכות שוק לאורך השנים האחרונות. הסטטיסטיקה מצביעה על כך כ -45% מכלל משיכות הן בשל השפעות לא רצויות על מערכת הלב וכלי הדם ^1. כישלון התרופה הזו לאחר התהליך ואישור התפתחותי היקר הוא התרחיש הגרוע ביותר עבור חברות תרופות. מחלקות מחקר ופיתוח ולפיכך להתמקד זיהוי של תופעות קרדיווסקולריות רצויות כגון מוקדם. אם יש לך חששות כלכליים ואתיים, המאמצים לצמצום ניסויים בבעלי החיים ולהחליפם מבחני מיון חדשים במבחנה נמשכת.

סט של מבחנים הוקמו כלולים מנהל המזון והתרופות בארה"ב (FDA) סוכנות ת....

Protocol

הערה: השלבים הבאים מתארים פרוטוקול תרבית תאים. אנא לבצע בתנאים סטריליים והשתמש במדיה מחומם מראש.

1. בידול הלב של hiPSC

1. לטפח את hiPSC

Discussion

רקמת לב מהונדסים מציעה אפשרות רבת ערך בתיבת כלי מחקר לב וכלי דם. EHTs בפורמט 24-היטב הוכיח יקר עבור מודלי מחלה ^{8, 14,} הקרנת בטיחות תרופת ^{7, 8, 10, 11, 15,} או למ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075