कार्डिएक औषधि सुरक्षा स्क्रीनिंग के लिए मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों की स्वचालित संकुचन विश्लेषण

Summary

यहाँ, हम मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों की पीढ़ी को दिखाने प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) cardiomyocytes व्युत्पन्न से। हम hERG चैनल अवरोध करनेवाला ई 4031 से संकुचन बल और संकुचन पैटर्न का अनुकरणीय परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि मजबूती और हृदय दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्तता के उच्च स्तर को दर्शाता है।

Abstract

कार्डिएक ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक का वर्णन तीन आयामी बल पैदा करने के लिए इंजीनियर के ऊतकों का गठन करने के। बुनियादी अनुसंधान और पूर्व नैदानिक ​​दवा के विकास में इन प्रक्रियाओं के कार्यान्वयन के लिए, यह मानकीकृत परिस्थितियों में स्वचालित पीढ़ी और विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम एक तकनीक पेश विभिन्न प्रजातियों (चूहा, माउस, मानव) के cardiomyocytes से इंजीनियर हृदय के ऊतकों (EHT) उत्पन्न करने के लिए। तकनीक एक फाइब्रिन-जेल में एक 24 अच्छी तरह प्रारूप में लोचदार polydimethylsiloxane (PDMS) पोस्ट के बीच अलग cardiomyocytes युक्त की विधानसभा पर निर्भर करता है। तीन आयामी, बल पैदा करने EHTs डालने के बाद दो सप्ताह के भीतर का गठन। (0.4-1.0 x 10 ⁶ / EHT) यह प्रक्रिया प्रति सप्ताह कई सौ EHTs की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है और तकनीकी रूप से cardiomyocytes की उपलब्धता के आधार पर ही सीमित है। auxotonic मांसपेशी संकुचन का मूल्यांकन एक mechan के साथ एक संशोधित ऊष्मायन कक्ष में किया जाता है24-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए iCal आलिंगन और एक कैमरा इस कक्ष के शीर्ष पर रखा। एक सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करता है एक कैमरा प्रत्येक EHT के लिए एक XYZ अक्ष सिस्टम पर ले जाया गया। EHT संकुचन एक स्वचालित आंकड़ा मान्यता एल्गोरिथ्म द्वारा पता लगाया जाता है, और बल EHT की कमी और लोचदार प्रवृत्ति और PDMS पदों की ज्यामिति के आधार पर गणना की जाती है। यह प्रक्रिया मानकीकृत और बाँझ शर्तों के तहत EHT की अत्यधिक संख्या के स्वचालित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। cardiomyocyte संकुचन पर दवा प्रभाव के विश्वसनीय पता लगाने हृदय दवा के विकास और सुरक्षा के औषध विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है। हम hERG चैनल अवरोध करनेवाला ई 4031 के उदाहरण के साथ, प्रदर्शित, कि मानव EHT प्रणाली मानव हृदय के संकुचन गतिकी पर दवा प्रतिक्रियाओं प्रतिकृति, जो यह दर्शाता है कि यह हृदय दवा सुरक्षा जांच के लिए एक आशाजनक उपकरण होने के लिए।

Introduction

इस तरह के दवा प्रेरित लंबे क्यूटी सिंड्रोम के रूप में कार्डिएक दुष्प्रभाव पिछले वर्षों में बाजार निकासी हुई है। सांख्यिकी संकेत मिलता है कि सभी निकासी का लगभग 45% हृदय प्रणाली ¹ पर अवांछित प्रभाव की वजह से कर रहे हैं। महंगा विकास की प्रक्रिया और अनुमोदन के बाद यह दवा विफलता दवा कंपनियों के लिए बुरी से बुरी हालत है। अनुसंधान और विकास विभागों इसलिए जल्दी पर इस तरह के अवांछित हृदय प्रभाव का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित। आर्थिक और नैतिक चिंताओं, पशु प्रयोगों को कम करने और उन्हें नए इन विट्रो स्क्रीनिंग assays के साथ बदलने के प्रयासों के लिए चल रही है।

स्थापित assays का एक सेट संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं ....

Protocol

ध्यान दें: निम्न चरणों के एक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन। कृपया बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन करने और पूर्व गर्म मीडिया का उपयोग करें।

1. hiPSC की कार्डिएक विभेदन

1. hiPSC खेती
   1. कोट 6 अच्.......

Discussion

इंजीनियर हृदय के ऊतकों हृदय अनुसंधान के टूल बॉक्स करने के लिए एक मूल्यवान विकल्प प्रदान करता है। 24-अच्छी तरह प्रारूप में EHTs रोग मॉडलिंग ^{8, 14,} दवा सुरक्षा स्क्रीनिंग ^7,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075