Automatisert Sammentrekning Analysis of Human Engineered hjertevev for Cardiac Drug Safety Screening

Summary

Her viser vi generering av human konstruert hjertevev fra induserte pluripotente stamceller (hiPSC) -avledede kardiomyocytter. Vi presenterer en metode for å analysere kontraksjonskraft og eksempelvise endring av sammentrekning mønster av hERG kanal inhibitor E-4031. Denne fremgangsmåten viser høy grad av robusthet og egnethet for hjertelegemiddelscreening.

Abstract

Hjertevev teknikk beskrives teknikker for å danne tredimensjonale kraftgenerer utviklet vev. For gjennomføring av disse prosedyrene i grunnforskning og prekliniske narkotika utvikling, er det viktig å utvikle protokoller for automatisert produksjon og analyse under standardiserte betingelser. Her presenterer vi en teknikk for å generere Engineered hjertevevet (EHT) fra kardiomyocytter fra forskjellige arter (rotte, mus, menneske). Teknikken er basert på montering av en fibrin-gel inneholdende dissosierte kardiomyocytter mellom elastisk polydimetylsiloksan (PDMS) poster i en 24-brønners format. Tredimensjonal, kraftgenererende EHTs utgjør i løpet av to uker etter støping. Denne prosedyren tillater generering av flere hundre EHTs per uke og er teknisk begrenset av tilgjengeligheten av cardiomyocytes (0,4-1,0 x 10 ⁶ / EHT). Evaluering av auxotonic muskelsammentrekninger blir utført i en modifisert inkubasjon kammer med en mechanical sperre for 24-brønners plater og et kamera plassert på toppen av dette kammer. En programvare styrer et kamera beveget på en XYZ aksesystem til hver EHT. EHT trekningene detekteres ved hjelp av en automatisk gjenkjennelse figur algoritme, og kraft blir beregnet basert på forkortning av høyspenningen og den elastiske tilbøyelighet og geometri av PDMS innlegg. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for automatisk analyse av et høyt antall EHT under standardiserte og sterile betingelser. Den pålitelige påvisning av narkotika effekter på cardiomyocyte sammentrekning er avgjørende for hjertelegemiddelutvikling og sikkerhetsfarmakologi. Vi viser, med det eksempel på den hERG kanal inhibitor E-4031, som det menneskelige EHT-systemet reproduserer legemiddel svarene på sammentrekningskinetikken til det menneskelige hjerte, noe som indikerer at det skal være et viktig verktøy for hjerte medikament sikkerhet screening.

Introduction

Hjerte bivirkninger som legemiddelindusert lang QT-syndrom har ført til markeds uttak i løpet av de siste årene. Statistikk viser at ca 45% av alle uttak skyldes uønskede effekter på det kardiovaskulære systemet ^1. Dette stoffet svikt etter den dyre utviklingsprosess og godkjenning er det verst tenkelige scenario for farmasøytiske selskaper. Forskning og utvikling avdelinger fokuserer derfor på påvisning av slike uønskede kardiovaskulære effekter tidlig. Av økonomiske og etiske hensyn, innsats for å redusere dyreforsøk og erstatte dem med nye in vitro screening-analyser er pågående.

Et sett av etablerte an....

Protocol

MERK: Følgende trinn beskriver en cellekultur protokoll. Vennligst utføre under sterile forhold og bruke forvarmet medier.

1. Cardiac Differensiering av hiPSC

1. Dyrke hiPSC
   1. Coat 6-brønners plater (1 ml / brønn) eller T75-kolber (7 ml / kolbe) med redusert vekstfaktor basalmembran matriks (f.eks geltrex, 1: 200; se tabell material) fortynnet i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) for 30 minutter ved 37 ° C. Forbered FTDA medium

Discussion

Konstruert hjertet vev tilbyr en verdifull mulighet til verktøykasse av kardiovaskulær forskning. EHTs i 24-brønners-formatet har vist seg verdifull for sykdom modellering ^{8, 14,} narkotika sikkerhet screening ^{7, 8, 10, 11, 15,} eller basisk Cardiovascular Research ^16,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075