Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Summary

Aqui, mostramos a geração de tecido do coração humano manipulado a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSC) derivada de cardiomiócitos. Apresenta-se um método para analisar a força de contração e alteração exemplar de padrão de contracção pelo hERG inibidor do canal de E-4031. Este método apresenta elevado nível de robustez e de aptidão para o rastreio de drogas cardíaca.

Abstract

engenharia de tecido cardíaco descreve técnicas para constituir três tecidos de engenharia geradores de força dimensional. Para a implementação destes procedimentos em pesquisa básica e desenvolvimento de medicamentos pré-clínico, é importante desenvolver protocolos para geração e análise automatizada sob condições padronizadas. Aqui, apresentam-se de uma técnica para gerar tecido do coração Engineered (EHT) de cardiomiócitos de espécies diferentes (rato, ratinho, humano). A técnica baseia-se na montagem de uma fibrina-gel contendo cardiomiócitos dissociadas entre polidimetilsiloxano elástico (PDMS) postos em um formato de 24 poços. Tridimensionais, EHTs geradores de força constituem dentro de duas semanas após a fundição. Este procedimento permite a geração de várias centenas de EHTs por semana e é tecnicamente limitado apenas pela disponibilidade de cardiomiócitos (0,4-1,0 x 10 ⁶ / EHT). Avaliação das contracções musculares auxotonic é executada numa câmara de incubação modificado com um mechanintertravamento ical para placas de 24 poços e uma câmara colocada no topo desta câmara. Um software controla uma câmara moveu-se sobre um sistema de eixos XYZ para cada EHT. EHT contracções são detectadas por um algoritmo figura reconhecimento automatizado, e força é calculada com base no encurtamento do EHT e a propensão elástica e geometria dos postes PDMS. Este procedimento permite a análise automática de um número elevado de EHT sob condições padronizadas e estéreis. A detecção confiável de efeitos de drogas sobre a contração dos cardiomiócitos é crucial para o desenvolvimento de drogas cardíaca e farmacologia de segurança. Demonstramos, com o exemplo do hERG inibidor do canal de E-4031, de que o sistema EHT humano replica de respostas ao fármaco sobre a cinética de contracção do coração humano, indicando que ele seja uma ferramenta promissora para o rastreio de segurança de medicamentos cardíaca.

Introduction

efeitos colaterais cardíacos, tais como a síndrome do QT longo induzido por drogas levaram a retiradas do mercado ao longo dos últimos anos. As estatísticas indicam que cerca de 45% de todas as retiradas são devido a efeitos indesejáveis sobre o sistema cardiovascular ^1. Esta falha de drogas após o processo de desenvolvimento caro e aprovação é o pior cenário para as empresas farmacêuticas. departamentos de pesquisa e desenvolvimento, portanto, concentrar-se na detecção de tais efeitos cardiovasculares indesejáveis ​​logo no início. Para preocupações econômicas e éticas, os esforços para reduzir as experiências com animais e substituí-los com ....

Protocol

NOTA: Os passos seguintes descrevem um protocolo de cultura de células. Por favor realizar sob condições estéreis e usar meios de pré-aquecido.

1. cardíaca Diferenciação de hiPSC

1. Cultivar a hiPSC
   1. Revestir placas de 6 poços (1 ml / cavidade) ou frascos T75 (7 ml / frasco) com matriz de membrana basal reduzida do factor de crescimento (por exemplo geltrex, 1: 200; ver tabela de materiais) diluída em meio de Eagle modificado por Dulbecco (.......

Discussion

tecido do coração Engineered oferece uma opção valiosa para a caixa de ferramenta de pesquisa cardiovascular. EHTs no formato de 24 poços provaram valiosa para a modelagem de doença ^{8, 14,} o rastreio de segurança de medicamentos ^{7, 8, 10, 11, 15,} ou de investigação cardiovascular básica

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075