Автоматизированный анализ Сужение человеческого Engineered ткани сердца для скрининга сердца безопасности лекарственных средств

Summary

Здесь мы покажем генерацию человеческой инженерии сердечной ткани от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) -derived кардиомиоцитов. Мы представляем метод анализа сжатия силы и примерное изменение сжатия рисунка с помощью ингибитора HERG канала E-4031. Этот метод показывает высокий уровень надежности и пригодности для сердечного скрининга лекарственных средств.

Abstract

инженерные ткани сердца описывается методы для образования трехмерных силы, генерирующей инженерии тканей. Для осуществления этих процедур в области фундаментальных исследований и разработках доклинических наркотиков, важно разработать протоколы для автоматической генерации и анализа в стандартных условиях. Здесь мы представляем технику для создания Engineered ткани сердца (EHT) из кардиомиоцитов различных видов (крысы, мыши, человек). Метод основан на сборке фибринового-гель, содержащий диссоциированные кардиомиоцит между упругой полидиметилсилоксан (PDMS) сообщениями в формате 24-луночного. Трехмерная, силогенерирующая EHTs составляет в течение двух недель после отливки. Эта процедура позволяет генерировать несколько сотен EHTs в неделю и технически ограничен только наличием кардиомиоцитов (0,4-1,0 × 10 ⁶ / EHT). Оценка auxotonic мышечных сокращений производится в модифицированной инкубационной камере с Mechanческие блокировки для 24-луночных планшетов и камеры размещены в верхней части этой камеры. Программное обеспечение управление камерой перемещается по системе координат XYZ каждой EHT. EHT сокращение обнаруживается с помощью автоматизированного алгоритма распознавания фигуры, а сила рассчитываются на основе укорочения EHT и упругой склонность и геометрии сообщений PDMS. Эта процедура позволяет автоматизированного анализа большого числа EHT в стандартных и стерильных условиях. Надежное обнаружение эффектов препарата на кардиомиоциты сокращения имеет решающее значение для развития сердца наркотиков и безопасности фармакологии. Мы демонстрируем, с примером HERG ингибитора канала E-4031, что человеческая система EHT размножается реакции лекарственного препарата на сжимающих кинетике человеческого сердца, что указывает на то, чтобы быть перспективным инструментом для скрининга сердца безопасности лекарственных средств.

Introduction

Сердечные побочные эффекты, такие как синдром длительного медикаментозного интервала QT привели к рыночному снятию за последние года. Статистические данные показывают , что около 45% всех снятий обусловлены нежелательных эффектов на сердечно - сосудистую систему ^1. Эта неудача наркотиков после дорогостоящего процесса и утверждения развития является наихудшим сценарием для фармацевтических компаний. Поэтому научные исследования и разработки отделов сосредоточиться на выявлении таких нежелательных сердечно-сосудистых эффектов на ранних стадиях. Для экономических и этических проблем, усилия по сокращению экспериментов на животных и заменить их но....

Protocol

Примечание: Следующие шаги описывают протокол для культивирования клеток. Выполните в стерильных условиях и использовать подогретые СМИ.

1. Сердечная Дифференциация hiPSC

1. Развивайте hiPSC
   1. Шерсть 6-луночные планшеты (1 мл / лунка) или колбы Т75 (7 мл / колба) с ?.......

Discussion

Engineered ткань сердца предлагает ценный вариант для панели инструментов сердечно-сосудистых исследований. EHTs в формате 24-луночного доказали свою ценность для моделирования болезни ^{8, 14,} безопасности лекарственных средств скрининга ^7,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075