Automatiserad Contraction analys av Human Engineered hjärtvävnad för Cardiac Drug Safety Screening

Summary

Här visar vi generering av human engineered hjärtvävnad från inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) -härledda kardiomyocyter. Vi presenterar en metod för att analysera kontraktionskraften och exemplarisk förändring av kontraktion mönster av hERG-kanal-inhibitorn E-4031. Denna metod visar hög nivå av robusthet och lämplighet för hjärtläkemedelsscreening.

Abstract

Hjärtvävnadsteknik beskriver tekniker för att utgöra tredimensionella kraftalstrande manipulerade vävnader. För genomförandet av dessa förfaranden i grundforskning och preklinisk läkemedelsutveckling, är det viktigt att utveckla protokoll för automatiserad produktion och analys under standardiserade förhållanden. Här presenterar vi en teknik för att generera Engineered hjärtvävnad (EHT) från kardiomyocyter av olika arter (råtta, mus, människa). Tekniken förlitar sig på monteringen av en fibrin-gel innehållande dissocierade kardiomyocyter mellan elastiska polydimetylsiloxan (PDMS) inlägg i en 24-brunnsformat. Tredimensionella, kraftalstrande EHTs utgör inom två veckor efter gjutning. Denna procedur möjliggör för generering av flera hundra EHTs per vecka och är tekniskt begränsad endast av tillgängligheten av kardiomyocyter (0,4-1,0 x 10 ⁶ / EHT). Utvärdering av auxotonic muskelsammandragningar utförs i en modifierad inkubation kammare med en mechanical interlock för 24-brunnsplattor och en kamera placerad på toppen av denna kammare. En programvara styr en kamera flyttas på ett XYZ axelsystem till varje EHT. EHT kontraktioner detekteras av en automatiserad figur igenkänningsalgoritm, och kraft är beräknad baserat på förkortning av EHT och det elastiska benägenhet och geometrin hos PDMS inlägg. Denna procedur gör det möjligt för automatisk analys av ett stort antal EHT under standardiserade och sterila förhållanden. Den tillförlitlig detektering av läkemedelseffekter på cardiomyocyte kontraktion är avgörande för hjärt läkemedelsutveckling och säkerhetsfarmakologi. Vi visar, med exempel på den hERG-kanalen inhibitorn E-4031, att det mänskliga EHT systemet replikerar läkemedelssvar på sammandragnings kinetiken för det mänskliga hjärtat, vilket indikerar att det är ett lovande verktyg för hjärtläkemedelssäkerhet screening.

Introduction

Hjärt biverkningar såsom läkemedelsinducerad långt QT-syndrom har lett till återtag från marknaden under de senaste åren. Statistik visar att cirka 45% av alla uttag beror på oönskade effekter på det kardiovaskulära systemet ^1. Detta läkemedel misslyckande efter den dyra utvecklingsprocess och godkännande är det värsta scenariot för läkemedelsföretag. Forsknings- och utvecklingsavdelningarna fokusera därför upptäckt av sådana oönskade kardiovaskulära effekter tidigt. Av ekonomiska och etiska frågor, insatser för att minska djurförsök och ersätta dem med nya in vitro-screeningsanalyser pågår.

En uppsättning....

Protocol

OBS! Följande steg beskriver en cellodlingsprotokoll. Utför under sterila förhållanden och använda förvärmda media.

1. Cardiac Differentiering av hiPSC

1. Odla hiPSC
   1. Coat 6-brunnsplattor (1 ml / brunn) eller T75-kolvar (7 ml / kolv) med nedsatt tillväxtfaktor basalmembranmatris (t.ex. geltrex, 1: 200, se tabell av material) utspädd i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) för 30 min vid 37 ° C. Förbereda FTDA mediet ^.......

Discussion

Engineered hjärtvävnad ger ett värdefullt alternativ till verktygslåda av kardiovaskulär forskning. EHTs i 24-brunnsformatet har visat sig värdefulla för sjukdom modellering ^{8, 14,} läkemedelssäkerhet screening ^{7, 8, 10, 11, 15,} eller basisk kardiovaskulär forskning ^16,.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075