Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Summary

uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) kardiyomiyositlerini -türevlenmiş dan Burada, insan mühendisliği kalp dokusu üretimini göstermektedir. Biz hERG kanalı inhibitörü e-4031 ile büzülme kuvveti ve kasılma biçimi örnek değişiklik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, kalp ilaç taraması için sağlamlık ve uygunluğu yüksek seviyesini gösterir.

Abstract

Kardiyak doku mühendisliği üç boyutlu güç üreten işlenmiş dokular oluşturacak teknikleri tarif etmektedir. temel araştırmalar ve klinik öncesi ilaç geliştirilmesinde bu prosedürlerin uygulanması için, standart koşullar altında otomatik üretimi ve analiz için protokoller geliştirmek önemlidir. Burada, farklı türlerin (fare, sıçan, insan) kardiyomiyositlerden projelendirilmiş kalp dokusu (EHT) üretmek için bir yöntem sunulmaktadır. teknik 24 oyuklu bir formatta elastik polidimetilsiloksan (PDMS), destekler arasındaki ayrışmış kardiyomiyositlerde içeren bir fibrin jel montajı dayanır. Üç boyutlu, kuvvet üreten EHTs dökümden sonra iki hafta içinde oluşturmaktadır. Bu işlem, haftada birkaç yüz EHTs üretilmesine imkan tanır ve teknik olarak kardiyomiyositlerin mevcudiyeti ile kısıtlanır (0.4-1.0 x 10 ⁶ / EHT). auxotonic kas kasılmaları Değerlendirilmesi mechan ile değiştirilmiş bir inkübasyon odası içinde gerçekleştirilirik 24 oyuklu plakalar için kilitleme ve bu haznenin üzerine yerleştirilen bir kamera. Bir yazılım kamera her EHT bir XYZ eksen sistemine taşındı kontrol eder. EHT kasılmalar otomatik bir şekil tanıma algoritması ile tespit edilir, ve bir güç PDMS mesajların EHT kısalması ve elastik eğilimi ve geometrisine göre hesaplanır. Bu prosedür standardize ve steril koşullar altında EHT yüksek sayıda otomatik analizi için izin verir. Kardiyomiyosit kasılması üzerindeki ilaç etkileri güvenilir algılama kardiyak ilaç geliştirme ve emniyet farmakoloji açısından çok önemlidir. İnsan EHT sistemi kardiyak ilaç güvenliği taraması için gelecek vaat eden bir araç olarak gösteren, insan kalbin kasılma kinetiği üzerindeki ilaç yanıtları çoğaltır, hERG kanalı inhibitörü E-4031 örneği ile, gösterir.

Introduction

Böyle ilaca bağlı uzun QT sendromu gibi kardiyak yan etkiler son yıllarda pazar çekme yol açmıştır. İstatistikler her çekme yaklaşık% 45'i kardiyovasküler sistem ¹ istenmeyen etkileri nedeniyle olduğunu göstermektedir. Pahalı gelişimsel süreç ve onayından sonra bu ilaç yetmezliği ilaç firmaları için en kötü durum senaryosu. Araştırma ve geliştirme departmanları bu nedenle erken dönemlerinde bu istenmeyen kardiyovasküler etkilerin tespiti odaklanır. Ekonomik ve etik kaygılar, hayvan deneyleri azaltmak ve yeni in vitro tarama deneyleri ile bunların yerine çabaları için devam etmektedir.

Yerleşik tahlille....

Protocol

NOT: Aşağıdaki adımlar, bir hücre kültürü protokol açıklar. Steril şartlarda gerçekleştirmek ve önceden ısıtılmış medyayı kullanın.

hiPSC 1. Kalp Farklılaşma

1. hiPSC Yetiştirmek
   1. Kaplama 6 oyuklu plakalar (1 ml / havuz) ya da daha düşük büyüme faktörü taban membran matrisi ile T75 şişesi (7 mL / şişe) (örneğin geltrex, 1: 200, malzeme tabloya bakınız) Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında seyrelti.......

Discussion

Tasarlanmış kalp dokusu kardiyovasküler araştırma aracı kutusuna değerli bir seçenek sunuyor. 24-kuyu formatında EHTs hastalık modelleme ^{8, 14,} ilaç güvenliği taraması ^{7, 8, 10, 11, 15,} ya da temel kardiyovasküler araştırma ^{16, 17}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075