Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl

Resumen

El desarrollo de la glándula mamaria en el roedor se ha evaluado típicamente mediante evaluaciones descriptivas o mediante la medición de atributos físicos básicos. La densidad de ramificación es un indicador del desarrollo mamario que es difícil de cuantificar objetivamente. Este protocolo describe un método fiable para la evaluación cuantitativa de las características de ramificación de las glándulas mamarias.

Resumen

Un número creciente de estudios están utilizando la glándula mamaria de roedor como punto final para evaluar la toxicidad de desarrollo de una exposición química. Los efectos que estas exposiciones tienen en el desarrollo de la glándula mamaria se evalúan típicamente usando mediciones dimensionales básicas o marcando características morfológicas. Sin embargo, la amplia gama de métodos para interpretar los cambios en el desarrollo podría llevar a traducciones inconsistentes entre los laboratorios. Se necesita un método común de evaluación para que las interpretaciones adecuadas puedan formarse a partir de los datos que se comparan entre los estudios. El presente estudio describe la aplicación del método de análisis Sholl para cuantificar las características de ramificación de las glándulas mamarias. El método de Sholl se desarrolló originalmente para su uso en la cuantificación de patrones dendríticos neuronales. Mediante el uso de ImageJ, un paquete de software de análisis de imágenes de código abierto, y un complemento desarrollado para este análisis, la densidad de ramificación de la glándula mamaria y la complejidad de la amSe determinó la glándula mamaria de una rata hembra peripubertal. Los métodos descritos aquí permitirán el uso del análisis de Sholl como una herramienta eficaz para cuantificar una característica importante del desarrollo de la glándula mamaria.

Introducción

La ramificación de las glándulas mamarias es una característica que comúnmente se evalúa como un indicador del desarrollo de las glándulas, pero es difícil de cuantificar objetivamente. En 1953, Sholl ¹ describe un método para medir arborización dendrítica neuronal en las cortezas visuales y motoras del gato, y un plugin para esta técnica fue desarrollada por Ferriera et al ^2. Debido a que las neuronas y las glándulas mamarias exhiben una estructura parecida a un árbol similar, el plugin se empleó para cuantificar las densidades de ramificación epitelial mamaria en imágenes 2D de la glándula mamaria peripubertal de rata. La etapa peripuberal fue elegida para el análisis porque el destete es una etapa de la vida que se evalúa a menudo en los laboratorios académicos y los estudios de la guía de la prueba. El análisis de Sholl es un plugin distribuido con FIJI, que es el paquete de procesamiento de imágenes de código abierto ImageJ, con complementos adicionales incluidos. El complemento crea una serie de anillos concéntricos que rodean un prefijo(Típicamente el soma de una neurona o el origen del conducto primario de una glándula mamaria) y extendiéndose hacia fuera hasta la porción más distal del objeto (el radio envolvente). A continuación, cuenta el número de intersecciones (N) que se producen en cada uno de los anillos. El complemento también devuelve un coeficiente de regresión de Sholl ( k ), que es una medida de la tasa de decaimiento de la ramificación epitelial.

Utilizando ImageJ, se crea una imagen esqueletizada de una glándula mamaria de montaje completo y se mide el área epitelial mamaria (MEA). La imagen se analiza utilizando el plugin de análisis de Sholl, y se devuelven valores para N yk , entre otros valores no utilizados aquí. La densidad de ramificación epitelial mamaria se determina mediante el cálculo de N / MEA. La extensión a la cual la ramificación continúa en las regiones externas del epitelio glandular es la complejidad de la ramificación y es un indicador del crecimiento epitelial distal uniforme. Como k es una medida de la disminución distal en epítetoEs una medida eficaz de la complejidad ramificada y un indicador fiable del desarrollo mamario.

Este protocolo describe un método asistido por ordenador para crear imágenes esqueletizadas de glándulas mamarias globales y evaluar cuantitativamente las características de ramificación mamaria en ratas peripuberales macho y hembra. Este método es relativamente rápido y no requiere el uso de equipos de microscopía especializados. El desarrollo y la validación de este método se describen en Stanko et al. (2015) ³ . Este informe también describe la preparación de glándulas mamarias de rata enteras = monturas. Se han descrito procedimientos mamarios de montaje completo similares en de Assis et al. (2010) ⁴ y Plante et al. (2011) ⁵ .

Protocolo

Todos los usos y procedimientos de los animales para este estudio fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Laboratorio del NIEHS y llevados a cabo en una instalación acreditada por la Asociación de Evaluación y Acreditación de Laboratorios de Cuidado de Animales.

1. Glándulas mamarias de los impuestos especiales

1. Pre-etiquete todas las diapositivas con un método a prueba de xileno (el lápiz funciona mejor). Cubrirlos con una solución de montaje al final para preservar la etiqueta.
2. Eutanasiar el animal mediante un método aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
3. Después de la eutanasia, coloque el animal en su espalda en una tabla de disección ( Figura 1 ). Estirar y fijar las cuatro extremidades, con las extremidades posteriores formando una V invertida (agujas de mantenimiento o agujas de calibre pequeño funcionan bien).
4. Rocíe abundantemente el abdomen con etanol al 70% para mantener el pelo fuera de la muestra mamaria.
5. Usando fórceps, levante la piel abdominal en la línea media y haga una pequeña incisión conDiseccionando las tijeras, teniendo cuidado de no perforar el peritoneo.
   1. Comenzando en la incisión, corte la piel hasta la región del cuello y luego distalmente al miembro delantero. Reducir a la región inguinal y luego distalmente a la primera articulación de la extremidad trasera en el mismo lado; Esta incisión normalmente separa las glándulas mamarias 5 y 6. Evite cortar el peritoneo.
   2. Retirar la piel con la almohadilla de grasa mamaria adjunta usando una pinza, separándola suavemente del peritoneo usando el extremo romo de las tijeras de disección. Separe lo más profundamente posible para exponer completamente las glándulas mamarias inguinal ^4ª y ^5ª en la parte inferior de la piel; Fije la piel al tablero de disección ( Figura 2 ).
   3. Agarrar suavemente el tejido mamario de la ^5ª glándula con el lado redondeado de pinzas curvas y lentamente recortar la glándula de la piel, teniendo cuidado de no nick la glándula o la piel.
   4. Continúe recortando,Moviéndose dorsalmente hasta que las glándulas 4 ^ª y 5 ^ª hayan sido completamente levantadas de la piel. Asegúrese de que la región del pezón se retira con el resto de la glándula, ya que esto sirve como punto de partida para el análisis Sholl. Cortar el tejido mamario lejos del cuerpo donde se adhiere a la glándula 4.
6. Una vez que la glándula se retira del animal, esparcir uniformemente sobre una diapositiva de microscopía de 25 mm x 75 mm x 1 mm cargada electrostáticamente, con el lado que estaba adyacente a la piel hacia abajo.
   NOTA: Para las glándulas de animales más viejos o lactantes, una diapositiva de 51 x 75 x 1 mm puede ser necesaria.
7. Mientras usa guantes, apriete suavemente las burbujas de aire. Cubrir la glándula con una película de parafina de plástico y otro portaobjetos de microscopio y comprimir la glándula para adherirla a la diapositiva.
   NOTA: Un tubo cónico de 50 ml lleno de agua sirve como un peso adecuado. La cantidad de tiempo necesario para adherirse a la corredera depende del espesor de la glándula. Thin, postna(PND) 4 glándulas deben comprimirse durante un mínimo de 30 min, mientras que las glándulas adultas más gruesas pueden requerir hasta 2-5 h.

2. Preparar los Montes Mamarios

1. Prepare la solución de alumbre de carmín al menos 24 horas antes, ya que requiere hervir y refrigerar.
   1. Disolver 1 g de alúmina de carmín y 2,5 g de sulfato de aluminio y potasio (AlK (SO ₄ ) ₂ · 12H ₂ O) en 500 ml de agua destilada y dejar hervir durante 20 minutos en un matraz de 1 L. Llevar el volumen final a 500 ml usando agua destilada.
   2. Filtrar la solución a través de papel de filtro en un vacío y refrigerar para el almacenamiento.
      NOTA: La solución de alumbre de carmín puede reutilizarse pero debe descartarse cuando el color empiece a desvanecerse.
2. Antes de la fijación, pelar la película de parafina de la glándula, teniendo cuidado de no tirar de la glándula de la diapositiva. Coloque la (s) lámina (s) en una jarra de cristal y sumerja en un fijador (100% ethanOl, cloroformo y ácido acético glacial en una relación 6: 3: 1) durante 12-48 h, dependiendo del grosor de las glándulas.
3. Se vierte el fijador y se empapa las glándulas en etanol al 70% durante 15 min. Gradualmente rehidratar las glándulas mediante el vertido de 1/3 de la solución de etanol y reemplazarlo con agua destilada. Remoje durante 5 min. Repita este proceso tres veces.
4. Después del enjuague final, vierta toda la solución etanol / agua y reemplácela con agua destilada al 100%. Remoje las glándulas durante 5 min.
5. Vierta el agua destilada y sumerja las glándulas en la solución de alumbre de carmín. Mancha las glándulas durante 12-24 h, dependiendo del grosor.
   NOTA: Las glándulas no pueden ser demasiado teñidas, pero el tiempo de tinción para múltiples lotes debe ser el mismo, de modo que la intensidad de tinción sea la misma.
6. Vierta la solución de alumbre de carmín y enjuague las glándulas en agua destilada al 100% durante 30 s. Gradualmente deshidratar las glándulas empapándolas en etanol al 70% durante 15 min, etanol al 95% durante 15 min, unaNd etanol al 100% durante 20 min.
7. Borrar las glándulas de grasa remojándolas en xileno durante 12-72 h, dependiendo del grosor.
   NOTA: Las glándulas deben ser translúcidas (claras). Si quedan áreas opacas (blanquecinas), continúe remojándolas en xileno hasta que queden translúcidas. Si las glándulas lactantes o muy gruesas están siendo manchadas y eliminadas, el xileno puede necesitar ser reemplazado una vez para liberar completamente las glándulas.
8. Montar las diapositivas con un medio de montaje a base de xileno pipeteando suficiente medio para cubrir la glándula. Añadir un cubreobjetos, asegurando que no se forman burbujas de aire.
9. Deje que los portaobjetos se sequen. A medida que el medio de montaje se seca, se contrae bajo la cubreobjetos y puede ser necesario añadir medio de montaje adicional. Una vez que no se requiere ningún medio adicional, permita que las diapositivas se sequen completamente; Esto puede tomar 2-3 semanas.
10. Una vez que los portaobjetos están completamente secos, cualquier medio de montaje residual se puede retirar con un hisopo de algodón y una pequeña cantidad de xileno. Tenga cuidado de no usarDemasiado xileno, ya que esto puede disolver el medio de montaje y aflojar el cubreobjetos. Si esto ocurre y las burbujas de aire se acumulan debajo de la cubreobjetos, la cubreobjetos se debe quitar en xileno y el proceso de montaje debe repetirse.

3. Preparar imágenes de montaje completo para el análisis

1. Capture imágenes de montajes enteros ( Figura 3 ) usando un macroscopio o microscopio de disección y una cámara digital con el software apropiado.
   NOTA: Si bien se puede seleccionar cualquier ampliación que capte todo el epitelio glandular, es imprescindible capturar todas las imágenes de montaje completo que se compararán entre sí con la misma ampliación.
2. Descargue el software ImageJ (o el software FIJI) ⁶ .
3. Abra la imagen mamaria de montaje completo en ImageJ haciendo clic en "Archivo" → "Abrir". Seleccione la herramienta Mano a Mano y trace alrededor del epitelio glandular. Seleccione "Editar" & #8594; -El exterior claro.
   1. Quite los ganglios linfáticos trazando alrededor del nodo y usando la herramienta Mano a Mano y "Editar" → "Cortar".
4. Separe los canales de color seleccionando "Imagen" → "Color" → "Canales divididos". Seleccione el canal con el mejor contraste, típicamente el canal azul.
   NOTA: Una imagen RGB consiste en una pila de los componentes rojo, verde y azul de esa imagen. Esta acción separa estos componentes en tres imágenes de 8 bits en escala de grises.
5. Restar el fondo seleccionando "Proceso" → "Restar fondo". Seleccione los parámetros deseados y haga clic en "Vista previa" para ver los cambios.
   NOTA: "Restar fondo" elimina fondos continuos y suaves. Además, "Proceso" → "Filtros" → "Unsharp Mask" se puede utilizar para crear contraste.
6. Elige uno de los E los siguientes métodos para eliminar automáticamente el ruido: despeckle o remove outliers.
   NOTA: ImageJ ofrece un tercer método para la eliminación automática de ruido: quite NaNs. Sin embargo, el comando Eliminar NaNs no es aplicable ya que utiliza imágenes de 32 bits y el método actual utiliza imágenes de 8 bits.
   1. Elimine el ruido utilizando el comando despeckle seleccionando "Procesar" → "Ruido" → "Eliminar".
      NOTA: Esto es equivalente a agregar un filtro mediano, que reemplaza cada píxel con el valor mediano en su vecindario 3 × 3.
   2. Elimine el ruido utilizando el comando de eliminación de valores aleatorios seleccionando "Proceso" → "Ruido" → "Eliminar valores atípicos".
      NOTA: Este proceso reemplaza un píxel con la mediana de los píxeles en el entorno inmediato si se desvía de la mediana por más de un cierto valor (el umbral).
7. Elimine manualmente el ruido restante (Lass = "xfig"> Figura 4).
   1. Abra una copia de la imagen original y utilícela como guía para lo que es y lo que no es ruido. Haga clic en el botón de doble flecha roja situado en el extremo derecho de la barra de herramientas. Seleccione las herramientas de dibujo; Los botones de la herramienta de dibujo aparecerán ahora en la barra de herramientas.
   2. Haga clic en la herramienta Borrador. Ajuste el diámetro del borrador haciendo clic con el botón derecho en el botón de la herramienta Borrador. Mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón para borrar el ruido.
      NOTA: Sólo se puede deshacer una sesión de borrado. Una vez que el botón izquierdo del ratón se suelta y vuelve a hacer clic, la borradura anterior no se puede deshacer.
8. Ajuste el umbral seleccionando "Imagen" → "Ajustar" → "Umbral". Mueva los controles deslizantes para ajustar los valores umbral mínimo (control deslizante superior) y máximo (control deslizante inferior) hasta obtener una representación adecuada de la glándula.
   NOTA: Establecer el valor de umbral segmenta las imágenes en escala de grises en características de interés y de fondo.
   1. Haga clic en Aplicar. Si es necesario, elimine el ruido adicional en este punto siguiendo los pasos 3.6.1 y 3.6.2.
9. Reconstruir las porciones del epitelio glandular que se eliminaron por el umbral y la eliminación de ruido ( Figura 5 ].
   1. Realizar la reconstrucción de la imagen cuidadosamente y sobre una base mínima para mantener la integridad de la imagen original. Consulte la imagen original para obtener una referencia a lo que es y lo que no es epitelio.
   2. Haga clic en la herramienta Spray Can (en la barra de herramientas con las herramientas de dibujo). Ajuste el diámetro y la velocidad de pulverización haciendo clic con el botón derecho en el botón de la herramienta Spray Can. Rellene cuidadosamente las secciones que faltan de la glándula haciendo clic o manteniendo presionado el botón izquierdo del ratón.
10. Crear una imagen esqueletizada de la glándula para llevar a cabo el Análisis de Sholl. Asegúrese de que la imagen umbral sea binaria seleccionando "Proceso" → "Binario" → "Hacer B Inary ".
    1. Si la imagen es blanca sobre un fondo negro, seleccione "Procesar" → "Binario" → "Opciones" y desmarque "Fondo Negro". Esqueleice la imagen seleccionando "Proceso" → "Binario" → "Esqueleto".
       NOTA: Esto quita repetidamente los píxeles de los bordes de la imagen binaria hasta que se reduce a una forma de un solo píxel de ancho.
    2. Dilate la imagen una vez seleccionando "Proceso" → "Binario" → "Dilate".
       NOTA: Esto rellena las brechas creadas por el umbral y el esqueleto añadiendo píxeles a los bordes de la imagen binaria.
11. Guarde la imagen seleccionando "Archivo" → "Guardar como". Seleccione un tipo de imagen (normalmente jpeg), escriba el nombre del archivo y haga clic en "Aceptar".
12. Compruebe la exactitud de la imagen esqueletizada superponiendo la imagen esqueletizada en la imagen original (Ass = "xfig"> Figura 6).
    1. Cree una superposición abriendo tanto la imagen original como la imagen esqueletizada. Seleccione "Imagen" → "Superposición" → "Añadir imagen". En el cuadro de diálogo "Agregar imagen", seleccione la imagen de esqueleto del menú desplegable "Imagen a Agregar" y establezca la opacidad al 30%.
    2. Guarde la imagen de la imagen de esqueleto superpuesta en el original seleccionando "Archivo" → "Guardar como". Seleccione un tipo de imagen, escriba el nombre del archivo y haga clic en "Aceptar".

4. Realizar el Análisis de Sholl

1. Abra una imagen de esqueleto y realice el binario de imagen seleccionando "Proceso" → "Binario" → "Hacer binario".
   1. Antes de ajustar la escala de aumento, mida el número de píxeles / mm usando un micrómetro para la magnificación en la que se capturaron las imágenes.
   2. Ajustar la magnificación medida sSeleccionando "Analizar" → "Establecer escala". Introduzca el número de píxeles / mm. Ajuste la "Distancia conocida" y la "Relación de aspecto de píxel", tanto para 1. Introduzca "mm" para la "Unidad de longitud" y marque "Global" (mantiene la misma escala para cada imagen).
2. Determine el radio final (radio que lo rodea) para el análisis de Sholl, trazando una línea desde el inicio del conducto primario (centro de análisis) hasta el punto más distal del epitelio glandular ( Figura 7 ).
   1. Utilice la herramienta de dibujo lineal en la barra de herramientas para dibujar una línea entre los puntos de interés. Presione la tecla "M" para tomar una medida y observe que se abrirá una ventana de resultados.
      NOTA: El valor en la columna "Longitud" es la longitud de la línea en mm. Este valor se introducirá automáticamente como el radio final cuando se establecen los parámetros Sholl. El complemento Sholl utilizará el punto de partidaDe la línea como el centro de los anillos céntricos.
3. Ejecución del análisis Sholl.
   1. Ejecute el análisis seleccionando "Plugins" "Advanced Sholl Analysis"; Aparecerá una ventana de parámetros.
   2. Establecer el radio de inicio en "I. Definición de los depósitos" a 0,00 mm; La longitud de la línea medida en el paso 4.2 se introducirá automáticamente como el "radio final".
   3. Ajuste el "Tamaño de paso del radio" a 0.1 mm.
      NOTA: El tamaño del paso del radio determina el número de anillos (efectivamente el número de iteraciones); Un paso más pequeño aumentará el número de anillos, mientras que un paso más grande disminuirá el número de anillos. El radio no se puede establecer demasiado pequeño, aunque un radio excesivamente pequeño resultará en un número innecesariamente grande de anillos. Sin embargo, se puede configurar demasiado grande, lo que creará menos anillos y, posteriormente, subestimar el número verdadero de intersecciones. Véase Stanko et al.(2015) para obtener información adicional sobre la determinación del tamaño del paso.
   4. Establezca "# Muestras" en 1 y la "Integración" en "Media" en "II Múltiples Muestras por Radio".
   5. Ajuste el "Cutoff del radio de cierre" en 1 y marque "inferir desde el radio de inicio" para "# Primarios" en "III Descriptores y ajuste de la curva".
      NOTA: "Ajustar el perfil y calcular los descriptores" y "Mostrar detalles de ajuste" se pueden comprobar como se desee.
   6. Marque "Lineal" y seleccione "Mejor grado de ajuste" en "Perfiles sin normalización"; Marque "Más informativo". Seleccione "Area for Normalized Profiles" en "IV. Sholl Methods".
   7. Marque "Crear máscara de intersecciones" en "V. Opciones de salida" para crear un mapa de calor de las intersecciones (opcional).
   8. Haga clic en "Cf. Segmentación" para generar una ventana de vista previa de la imagen con anillos para confirmar el áreaDel análisis.
4. Haga clic en "Aceptar" para ejecutar el análisis.

5. Medición del MEA

1. Mida el MEA trazando la distancia más corta alrededor del árbol epitelial ( Figura 8 ).
   1. En ImageJ con la imagen de esqueleto de la glándula abierta, haga clic en la herramienta Polígono. Haga clic en un punto del perímetro del árbol epitelial para comenzar el polígono, desplazarse por el perímetro de la glándula y hacer clic para añadir un segmento de línea.
   2. Cuando todo el área epitelial ha sido eludido, haga doble clic para cerrar el polígono. Presione la tecla "M" para abrir una ventana de resultados; El valor en la columna "Área" es el MEA.
2. En los casos en que el epitelio glandular se ha extendido más allá del ganglio linfático, restar el área de los ganglios linfáticos (LNA) del MEA al calcular la densidad de ramificación.
   1. Medir el LNA mediante el seguimiento de los ganglios linfáticos en el mismo mannEr como el árbol epitelial y presionando "M."
      NOTA: El LNA debe ser restado del MEA en estos casos porque el ganglio linfático impide que el análisis cuente las intersecciones dentro del LNA. Cuando el epitelio no ha alcanzado el ganglio linfático, el LNA es cero.

6. Datos de los informes

1. Informe valores para el radio envolvente, MEA, N, k , y la densidad de ramificación.
   NOTA: El radio de inclusión se determina en el paso 4.2 y el MEA se determina en el paso 5.1.
   1. Ejecute el análisis para generar una ventana de resultados Sholl.
      NOTA: El N informado es el valor de la suma inters. El k informado es el valor para el coeficiente de regresión de Sholl (semi-log). El análisis de Sholl devolverá un valor para k sobre cualquier región medida del epitelio glandular. Para obtener un valor exacto para k sobre todo el epitelio, los extremos ductales deben estar presentes.
   2. ModificarE Análisis de Sholl para la glándula mamaria usando el valor de salida para N para calcular la densidad de ramificación (el punto final fundamental de este método). Calcular la densidad de ramificación utilizando la fórmula N / (MEA-LNA) y comunicar el valor como N / mm ^2.

Resultados

Los valores para el radio cerrado medido, MEA, N, k , y densidad de ramificación calculada para la glándula mamaria analizada en este protocolo se presentan en la Tabla 1 . El análisis de Sholl genera diagramas lineales y semi-log del número de intersecciones en cada radio ( Figura 9 ) y, si se selecciona, un mapa de calor de las intersecciones ( Figura 10 ). Las glándulas menos desarrolladas exhib...

Discusión

Desde el nacimiento hasta la pubertad, el crecimiento de la glándula mamaria es alométrico. Después de la pubertad, la glándula mamaria se desarrolla a través de ramificaciones ductales extensas y elongación, que continúan hasta que el epitelio mamario ocupa la almohadilla de grasa entera. Las características de ramificación son un aspecto importante del desarrollo de la glándula mamaria y la capacidad de cuantificar objetivamente estas características puede ser muy útil para evaluar el desarrollo mamario no...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting board	NA	NA	A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins	Daigger	EF7419A
Spray bottle with ethanol	NA	NA	70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors	Fine Science Tools	14569-09
Straight dissecing scissors	Fine Science Tools	14568-09
Curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001	Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.
Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm	Fisher scientific	12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Fisher scientific	13-374-12
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)	Sigma-Aldrich	24102
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Permount mounting media	Fisher Scientific	SP15
Macroscope	Leica	Z16 APO	This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera	Leica	DFC295
Camera software	Leica	Leica Application Suite v3.1
ImageJ software	Open source	http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis	Open source	http://imagej.net/Sholl_Analysis