Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e l'analisi degli isolati risultanti

Riepilogo

Librerie di visualizzazione batterica di Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta dei reagenti di affinità del peptide, un'alternativa affidabile agli anticorpi. Il metodo di ordinamento semi-automatizzato nel presente documento ha razionalizzato biopanning per ridurre l'occorrenza di falsi positivi. Qui illustriamo il processo di pensiero e tecniche applicate nella valutazione dei candidati e minimizzazione dell'analisi a valle.

Abstract

Librerie di visualizzazione batterica di Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta di reagente di affinità del peptide per il riconoscimento degli obiettivi sia biotici e abiotici. I reagenti di affinità del peptide possono essere utilizzati per applicazioni simili agli anticorpi, tra cui rilevamento e terapeutica, ma sono più robusti e in grado di eseguire in ambienti più estremi. Arricchimento specifico degli agenti di acquisizione di peptide ad un target di proteina di interesse è migliorata utilizzando metodi di ordinamento semi-automatizzati che migliorare associazione e lavare i passaggi e quindi diminuiscono l'avvenimento dei raccoglitori di falsi positivi. Un metodo di ordinamento semi-automatico è descritto nel presente documento per uso con una commerciale automatizzata magnetico attivato cella ordinamento dispositivo con un display batterico senza vincolato ordinamento biblioteca esprimendo casuale 15-mer peptidi. Con lievi modifiche, questi metodi sono estensibili ad altri automatizzato dispositivi, altre librerie di ordinamento e altri organismi. Un obiettivo primario di questo lavoro è quello di fornire una metodologia globale ed esporre il processo di pensiero applicato nell'analisi e riducendo al minimo la piscina risultante dei candidati. Queste tecniche includono l'analisi di associazione sul cellulare mediante fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS), per valutare l'affinità e specificità durante l'ordinamento e nel confronto tra singoli candidati, e l'analisi del peptide sequenze per identificare tendenze e sequenze di consenso per capire e potenzialmente migliorare l'affinità e specificità per la destinazione di interesse.

Introduzione

Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta del reagente di affinità, con batterico visualizzare librerie una fonte conveniente per peptide affinità reagenti ^{1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24}. Allo stesso modo dei fagi di visualizzazione ^25,26 e lievito visualizzare ^27,28, i peptidi sono esposti sulla superficie delle cellule e sono disponibili da associare agli obiettivi sia biotici ed abiotici, con queste interazioni guidato da sia la spina dorsale del peptide e le proprietà uniche delle catene laterali dell'amminoacido ²⁹. In contrasto con visualizzazione dei fagi, i batteri stessi sono auto-replicanti e contengono tutto materiale genetico necessario per la visualizzazione senza eluizione del fago associato e reinfezione delle cellule. In contrasto con visualizzazione di lievito, display batterica è più veloce a causa il rapido (circa 20 min ³⁰) raddoppiando il tempo di Escherichia coli. I reagenti di affinità del peptide risultante possono essere prodotto fuori cella da utilizzare in una varietà di piattaforme ^16,17,26 di rilevamento e hanno il potenziale per uso come materiali viventi quando visualizzato su-cell ^{2 , 31 , 32}. rispetto agli anticorpi monoclonali per il riconoscimento di obiettivi specifici, i peptidi sono molto più piccole e più flessibili, e librerie visualizzazione del peptide possono essere facilmente manipolate a livello del DNA, per evitare gli aminoacidi specifici, quale cisteina ³³ . Peptidi sono sempre più sfruttati per terapeutica ^34,35,36 e altre applicazioni dove gli anticorpi in genere sarebbero utilizzati a causa della loro facilità di individuazione, riproducibile sintetico (cella ) produzione e manutenzione superiore di prestazioni in ambienti estremi, fornendo un reagente funzionale anche dopo l'esposizione ad alte temperature o stoccaggio a lungo termine senza refrigerazione ^37,38. La capacità di superare la catena del freddo per la conservazione dei reagenti è di particolare interesse per il dipartimento della difesa, per esempio, che deve operare in ambienti estremi. Stabilità termica è stata pertanto una caratteristica desiderabile per i reagenti di affinità riconoscendo le destinazioni selezionate date come esempi in questo manoscritto.

Recentemente, librerie di visualizzazione batterica di biopanning è diventato ancora più semplice e affidabile con l'uso di semi-automatica magnetico-attivato delle cellule ordinamento (MACS o MCS) metodi ^9,14,39. Questi metodi sono stati dimostrati per bersagli biologici utilizzando diversi simili piattaforme con diversi vantaggi, tra cui un commercialmente disponibile di ordinamento automatizzato magnetico-attivato delle cellule (autoMACS o autoMCS) strumento di ordinamento (Vedi tabella di materiali) ^1,14,15 e dispositivi più specializzati che racchiudono il campione in una cartuccia usa e getta ^7,9 o chip ³⁹, una preziosa specifica per l'uso con gli organismi o le tossine che sono di livello 2 di biosicurezza (BSL-2) o superiore⁷. Questi metodi semi-automatizzati potrebbero essere esteso per ordinare per peptidi in grado di legarsi ai materiali abiotici in se i materiali sono magnetici o hanno la capacità di essere rivestito su magnetic beads e per l'uso con diversi organismi (come batteri anaerobici) se l'ordinamento e le condizioni di crescita sono alterate. Oltre alle librerie visualizzazione batterica di ordinamento, lo strumento di autoMCS commerciale utilizzato qui anche è stato utilizzato in parte per le fasi iniziali della scoperta di frammenti di anticorpo umano a catena singola visualizzata sulla superficie del lievito, seguita da ulteriore isolamento utilizzando fluorescente attivato Cell Sorting (FACS) ⁴⁰. I vantaggi primari ad semi-automazione sono diminuiti ordinamento tempo e fatica e più robusto e riproducibile eliminazione delle cellule non associate da biglie magnetiche durante le fasi di lavaggio, che porta alla riduzione di falsi positivi, meno giri di ordinamento richiesti e meno complicati downstream analisi ^9,14. Nel caso lo strumento commerciale autoMCS, ci sono più programmi pre-caricati che possono essere ottimale per diverse applicazioni, quali negativo pre-ordinamento (svuotamento), priorità purezza, minimizzando il volume di campione finale e aumentando o diminuendo la sensibilità per l'isolamento di cellule rare ⁴¹.

Il focus di questo lavoro è dimostrare la metodologia per biopanning una biblioteca di esposizione batterica utilizzando lo strumento di autoMCS disponibili in commercio e di esporre il processo di pensiero applicato nell'analisi e riducendo al minimo la piscina risultante dei candidati in al fine di facilitare l'estensione ad altre applicazioni. La libreria di display utilizzata qui (Vedi tabella materiali) ^12,13 contiene circa 10⁹- 10¹¹ 15-mer unico peptidi visualizzati tramite una versione modificata della proteina della membrana esterna batterica OmpX in un natura non vincolata alla superficie delle cellule, che dovrebbe essere rappresentativo del peptide libero in soluzione, se prodotta sinteticamente. Questa impalcatura di proteine inoltre contiene un peptide di controllo positivo P2X al C-terminale per il monitoraggio di espressione attraverso il legame YPet Mona. Tuttavia, una biblioteca acquistata o romanzo con diversità adatto e altre caratteristiche necessarie per l'applicazione specifica desiderata dovrebbe funzionare allo stesso modo con questa procedura di biopanning, anche se alcuni cambiamenti minori possono essere richiesti. Nella Figura 1è illustrato uno schema di questo protocollo di biopanning. Inoltre, il protocollo potrebbe essere adattato ad altri automatizzato piattaforme ordinamento magnetici e altre strategie di ordinamento. Cernita manuale magnetico con un magnete di benchtop è stata dimostrata con successo, anche se con analisi a valle più complicato e che richiede tempo richiesto dovuto aumentato falsi positivi ¹⁴e ciò nonostante fornisce un'opzione alternativa per la autoMCS passi se nessuna cella magnetica automatica l'ordinamento dispositivo è disponibile.

Protocollo

1. Biopanning batterica Display librerie utilizzando autoMCS

Nota: Questo protocollo di ordinamento basato su autoMCS è stato descritto in precedenza ¹⁴, e una più approfondita "espanso protocollo per nuovi utenti" è disponibili nei materiali supplementari per questo manoscritto per ulteriore dettaglio, compresa una spiegazione del potenziale modifiche. Se un dispositivo di autoMCS è disponibile per l'ordinamento, vedere il protocollo supplementare da Sarkes et al 2015 poiché un manuale l'ordinamento di protocollo è anche descritto in quanto lavoro ¹⁴. Il protocollo di autoMCS condizione qui è stato ulteriormente adattato per includere ulteriori passaggi di ordinamento negativi per una migliore specificità ^1,15. Nella Figura 1è illustrato uno schema di questo protocollo di biopanning.

1. Negativo l'ordinamento per rimuovere leganti probabile che cross-reagiscono con biglie magnetiche
   1. Inoculare 500ml di Luria brodo Miller (LB) contenente appropriato antibiotico con circa 1 x 10¹¹celle di un batterico diversificata visualizzare ordinamento biblioteca (Vedi tabella dei materiali).
      Nota: La visualizzazione batterica peptide libreria usata qui (Vedi tabella materiali) contiene circa 10⁹- 10¹¹membri univoci ^8,12 e viene coltivato in LB contenenti cloramfenicolo di 25 µ g/mL (LB Cm₂₅). La parte restante del presente protocollo si assume che questa libreria è utilizzata.
   2. Incubare a 37 ° C con agitazione a 225 giri/min fino a quando la cultura raggiunge un OD₆₀₀ di 0,5 - 0.55. Indurre l'espressione di peptidi con 0,04% w/v L-arabinosio diluendo un 4% di 1: 100 stock, agitazione a 225 giri/min per 45 min a 37 ° C.
   3. Posto ha indotto la cultura sul ghiaccio. Centrifugare circa 2 x 10¹¹ celle a 6000 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1,5 mL di PBS agitando delicatamente.
      Nota: Un OD₆₀₀ di 1.0 equivale circa a 1 x 10⁹ cellule/mL per e. coli.
      Nota: non vortice come questo può lisare le cellule; Risospendere a mano o agitando brevemente a ≤ 225 giri/min, 4° C.
   4. Trasferire le cellule a provette microcentrifuga e spin a 6.000 x g per 5 min a RT o 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL tamponato fosfato salino (PBS) contenente 0,5% albumina di siero bovino (BSA; PBS-B).
   5. Lavare 300 µ l di perline rivestite con streptavidina (circa 3 x 10⁹ perline, vedi tabella materiali) in 1 mL di PBS-B e centrifugare per 5 min a ≥ 5, 000 x g (a RT). Posizionare il tubo in un separatore di particelle magnetiche superiore di panca. Rimuovere con cautela il surnatante, evitando il pellet.
   6. Risospendere le perline nella cella più miscela di PBS-B preparato in precedenza. Incubare a 4° C su una piattaforma rotante per 45 min. campioni di posto sul ghiaccio.
   7. Accendere autoMCS strumento per inizializzare il sistema. Adescare linee di utilizzo run del produttore e buffer di lavaggio (Vedi tabella materiali) selezionando "Pulisci adesso" nella parte inferiore dello schermo nel menu di "Separazione", "Sciacquare" e "Run".
   8. Preparare il sistema con PBS-B, con PBS-B come tampone di lavaggio sia in esecuzione Buffer nei passaggi successivi. Selezionare il menu "Separazione" dalla barra di navigazione superiore e selezionare "Pulisci adesso". Selezionare "Sciacquare" e "Run" per preparare il sistema con fresco PBS-B.
   9. Trasferimento cellulare e perlina miscela dalla fase di incubazione a una provetta conica da 15 mL. Inserite questo tubo nella fessura del campione e svuotare le provette coniche da 15 mL negli slot selezione positiva e negativa, di un rack di pre-freddo (4 ° C) (Vedi tabella dei materiali). Posizionarla sulla piattaforma per la strumentazione.
   10. Assegnare un programma di separazione per ciascun campione sulla cremagliera (fino a 5 campioni possa essere ordinato in una sola volta). Aggiungere un passaggio di "Risciacquo" tra ogni campione e dopo l'ultimo campione. Selezionare "Esegui" per avviare la separazione delle cellule. Selezionare "OK" per confermare che sufficiente buffer è disponibile.
       Nota: Il programma di separazione "Posselds" funziona bene per l'ordinamento negativo e positivo l'ordinamento giro 1 e "Posseld" è comodo per l'ordinamento di giri 2-4, ma questi due programmi sono stati utilizzati con successo per tutto negativo e positivo l'ordinamento arrotonda ^{14 ,15} e altri programmi possono risultare migliore per una particolare applicazione (descritta più avanti in discussione).
   11. Quando il programma è completo, togliere la rastrelliera e conservare la frazione appropriata. Qui, per una sorta di negativa, è possibile mantenere negative frazioni (contenente cellule senza perline). Mettere sul ghiaccio.
   12. Utilizzare la frazione sorta negativo nella sua interezza per inoculare 1L di LB Cm₂₅ con 0,2% w/v D-glucosio. Crescere durante la notte a 37 ° C, agitando a 225 giri/min.
   13. Prima di spegnere lo strumento autoMCS, modificare il buffer gestito e lavare run del produttore e buffer di lavaggio (Vedi tabella dei materiali). Selezionare "Lavare ora", poi "Sciacquare" e "Run". Al termine dell'operazione, assicurarsi che ci sia etanolo al 70% della linea di decontaminazione, poi premere l'icona"potere" in alto a destra dello schermo e selezionare "Sì".
   14. Quando l'arresto del sistema è completo (le bottiglie sarà viola), spegnere la macchina.
   15. Il giorno successivo, utilizzare la cultura durante la notte per fare scorte di congelatore con circa 1 x 10 cellule¹¹per flaconcino in LB con 15% glicerolo. Inoltre, o in alternativa, è possibile utilizzare questa cultura nel passaggio successivo: ulteriori negativo l'ordinamento (sezione 1.2) o al primo turno dell'ordinamento positivo (sezione 1.3).
2. Negativo l'ordinamento per rimuovere leganti probabile che cross-reagiscono con altri obiettivi di interesse
   Nota: Sezione 1.2 possono essere saltati se nessun ulteriore ordinamento negativo è necessario o desiderato. In tal caso, procedere alla sezione 1.3. Residua associazione a tutti i bersagli indesiderati può essere valutata da FACS come sezione 2: analisi Citofluorimetrica di giri l'ordinamento.
   1. Per l'ordinamento negativa contro un bersaglio di proteine specifiche, ad esempio una proteina simile con potenziale da associare anche i peptidi scoperti ^1,15, ripetere i passaggi da crescita ed induzione 1.1.1 - 1.1.3, cominciando con un'azione congelate di libreria di streptavidina-vuotati da passo 1.1.15 o la cultura durante la notte dal passaggio 1.1.12 (utilizzando OD₆₀₀ per stimare e inoculare con cellule 1 x 10¹¹ ).
   2. Trasferire le cellule a provette microcentrifuga e spin a 6.000 x g per 5 min a RT o 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS contiene 600 nM biotinilati cross-reattivi della proteina target. Incubare a 4 ° C per 45 min su una piattaforma rotante.
      Nota: 600 nM è una concentrazione di partenza suggerita, che può essere modificata se è osservato un beneficio osservato. Biotinilazione della proteina bersaglio può essere raggiunto e quantificati utilizzando i reagenti suggerito nella tabella dei materiali.
   3. Nel frattempo, lavare 100 µ l di perline rivestite con streptavidina (circa 1 x 10⁹ perline) in 1 mL di PBS-B e centrifugare per 5 min a ≥ 5.000 x g (a RT). Posizionare il tubo in un separatore di particelle magnetiche superiore di panca e attentamente rimuovere surnatante, evitando il pellet.
   4. Centrifugare le cellule di destinazione associato a 6.000 x g per 5 min (RT o a 4° C), rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS-B. Risospendere perline in tutto il volume di cellule lavate legato al cross-reattivi della proteina bersaglio. Incubare a 4° C su una piattaforma rotante per 30 min.
   5. Collocare il campione su ghiaccio e completare i passaggi 1.1.7 - 1.1.15 per una sorta di negativa, fare scorte congelatore appropriato. Continuare a sezione 1.3 per una sorta di positiva se tutti cernita negativo desiderato è stato raggiunto, o ripetere la sezione 1.2 a negativo sorta contro un altro potenziale cross-reattivi della proteina.
3. Round 1 ordinamento positivo
   Nota: Round 1 ordinamento positivo contro una proteina specifica destinazione è simile a una sorta di negativa contro un bersaglio specifico ordinamento (Vedi 1.2) tranne che la frazione contenente perlina, positiva viene mantenuta.
   1. Inoculare 500 mL di LB Cm₂₅ con circa 1 x 10¹¹cellule di una diversificata batterico visualizzare ordinamento biblioteca che è stato impoverito di streptavidina e cresciuta durante la notte (dal passaggio 1.1.12) o congelati (dal passaggio 1.1.15) o decongelati sul ghiaccio, o che è stato ulteriormente impoverito di leganti ad altri target cross-reattivi della proteina (dal punto 1.2.5), come desiderato.
   2. Incubare a 37 ° C con agitazione a 225 giri/min fino a quando la cultura raggiunge un OD₆₀₀ di 0,5 - 0.55. Indurre l'espressione di peptidi con 0,04% w/v L-arabinosio diluendo un 4% di 1: 100 stock, agitazione a 225 giri/min per 45 min a 37 ° C.
   3. Posto ha indotto la cultura sul ghiaccio. Centrifugare circa 2 x 10¹¹ celle a 6.000 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1,5 mL di PBS agitando delicatamente (a mano o agitando brevemente a ≤ 225 giri/min, 4° C).
   4. Trasferire le cellule a provette microcentrifuga e spin a 6.000 x g per 5 min a RT o 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
   5. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS contenente 600 nM biotinilati proteina bersaglio di interesse. Incubare a 4 ° C per 45 min su una piattaforma rotante.
      Nota: 600 nM è una concentrazione di partenza suggerita, che può essere modificata se è osservato un beneficio osservato. Biotinilazione della proteina bersaglio può essere raggiunto e quantificati utilizzando i reagenti suggerito nella tabella dei materiali.
   6. Nel frattempo, lavare 100 µ l di perline rivestite con streptavidina (circa 1 x 10⁹ perline) in 1 mL di PBS-B e centrifugare per 5 min a ≥ 5.000 x g (a RT). Collocare la provetta in un separatore di particelle magnetiche superiore di panca e rimuovere con cautela il supernatante, evitando il pellet.
   7. Al termine dell'incubazione con destinazione, centrifugare le celle di destinazione associato a 6.000 x g per 5 min (RT o 4° C) per rimuovere qualsiasi proteina bersaglio non associato. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS-B. Risospendere perline in tutto il volume di cellule lavate associato alla proteina bersaglio. Incubare a 4° C su una piattaforma rotante per 30 min. posto sul ghiaccio.
   8. Accendere autoMCS strumento per inizializzare il sistema. Adescare linee di utilizzo run del produttore e buffer di lavaggio (Vedi tabella materiali) selezionando "Pulisci adesso" nella parte inferiore dello schermo nel menu di separazione, "Sciacquare" e "Run".
   9. Preparare il sistema con PBS-B, con PBS-B come tampone di lavaggio sia in esecuzione Buffer nei passaggi successivi. Selezionare il menu di separazione dalla barra di navigazione superiore e selezionare Pulisci adesso. Selezionare risciacquo e Run per preparare il sistema con fresco PBS-B.
   10. Trasferimento miscela delle cellule ed il branello da fase di incubazione sopra a un tubo conico da 15 mL, sciacquare il tubo con un ulteriori 500 µ l di PBS-B e il lavaggio con il campione di pool. Inserite questo tubo nella fessura del campione e svuotare le provette coniche da 15 mL negli slot selezione positiva e negativa, di un rack di pre-freddo (4 ° C) (Vedi tabella dei materiali). Posizionarla sulla piattaforma per la strumentazione.
   11. Assegnare un programma di separazione per ciascun campione sulla cremagliera (fino a 5 campioni possa essere ordinato in una sola volta). Aggiungere un passaggio di "Risciacquo" tra ogni campione e dopo l'ultimo campione. Selezionare "Esegui" per avviare la separazione delle cellule. Selezionare "OK" o "Continua" per confermare che sufficiente buffer è disponibile.
       Nota: Il programma di separazione "Posselds" funziona bene per l'ordinamento negativo e positivo l'ordinamento round 1 e "Posseld" è comodo per l'ordinamento di giri 2-4, ma questi due programmi sono stati utilizzati con successo per tutto negativo e positivo l'ordinamento round ^{14 , 15} e altri programmi possono risultare migliore per una particolare applicazione (descritta più avanti in discussione).
   12. Quando il programma è completo, togliere la rastrelliera e conservare la frazione appropriata. Qui, per un ordinamento positivo, è possibile mantenere positive frazioni (contenenti cellule e perline). Mettere sul ghiaccio.
   13. Prima di spegnere lo strumento autoMCS, modificare il buffer gestito e lavare run del produttore e buffer di lavaggio (Vedi tabella dei materiali). Selezionare "Lavare ora", poi "Sciacquare" e "Run". Al termine dell'operazione, assicurarsi che ci sia etanolo al 70% della linea di decontaminazione, poi premere l'icona"potere" in alto a destra dello schermo e selezionare "Sì".
   14. Quando l'arresto del sistema è completo (le bottiglie sarà viola), spegnere la macchina.
   15. Utilizzare la frazione sorta positivo nella sua interezza per inoculare 1L di LB Cm₂₅ con 0,2% w/v D-glucosio. Crescere durante la notte a 37 ° C, agitando a 225 giri/min.
   16. Il giorno successivo, utilizzare la cultura durante la notte a fare scorte di congelatore in LB contenente glicerolo al 15%, e/o continuare a positivo l'ordinamento giro 2 nella sezione 1.4.
4. Turni successivi di ordinamento positivi
   Nota: In genere, quattro giri di ordinamento sono raccomandati, anche se tre turni di ordinamento sono generalmente sufficienti ^14,15. Quando per interrompere l'ordinamento è assistito dall'analisi Citofluorimetrica di ordinamento round descritto nella sezione 2. Concentrazioni di destinazione e biglie magnetiche volume diminuiscono con ogni giro successivo di ordinamento positivo.
   1. Utilizzando le impostazioni cultura durante la notte dal turno precedente ordinamento (o uno stock di cellule congelate da quel round), inoculare 5ml LB Cm₂₅ con 100 µ l celle (01:50 diluizione). Incubare a 37° C con agitazione a 225 giri/min fino a quando la cultura raggiunge un OD₆₀₀ di 0,5 - 0.55.
   2. Indurre l'espressione di peptidi con 0,04% w/v L-arabinosio, agitazione a 225 giri/min per 45 min a 37° C. Posto hanno indotto le cellule sul ghiaccio.
      Nota: Questa cultura indotta utilizzabile anche per valutare l'affinità e specificità per il turno di ordinamento che ha provenuto da, come descritto nella sezione 2 di seguito.
   3. Centrifugare 1 x 10⁸ celle a 6.000 x g per 5 min a RT o 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 50 µ l PBS contenente metà della concentrazione di biotinylated proteina bersaglio di interesse utilizzato per il turno precedente di ordinamento (quindi 300 nM per round 2, 150 nM per round 3, 75 nM per turno 4 da nostri suggeriti punto di partenza). Incubare per 45 min in ghiaccio (o a 4 ° C una piattaforma rotante).
   4. Nel frattempo, lavare rivestite di streptavidina (15 µ l per round 2, 8 µ l per turno 3 e 4 µ l per round 4) in 1 mL di PBS-B e centrifugare per 5 min ≥ 5.000 x g (a RT). Posizionare il tubo in un separatore di particelle magnetiche superiore di panca e attentamente rimuovere surnatante, evitando il pellet. Risospendere perline in 50 µ l PBS-B.
   5. Dopo l'incubazione di 45 min con destinazione al punto 1.4.3, centrifugare le cellule a 6.000 x g per 5 min a temperatura ambiente o a 4° C, eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 50 μl lavato perline da 1.4.4. Mantenere il campione sul ghiaccio e completare i passaggi 1.3.7 - 1.3.13 per un ordinamento positivo.
   6. Inoculare una cultura di 5 mL di LB Cm₂₅ completati con 0,2% w/v D-glucosio con la frazione positiva, tallone-contenendo intera dalla specie.
   7. Il giorno successivo, utilizzare la cultura durante la notte per fare scorte di congelatore in LB contenente glicerolo al 15% e/o continuare all'ordinamento positivo prossimo turno, tornando al punto 1.4.1.
      Nota: Utilizzando la cultura indotta da 1.4.2 a valutare l'affinità e specificità come descritto nella sezione 2 qui sotto può aiutare a determinare quando interrompere l'ordinamento. Se ordinamento due turni di fila mostrano affinità di legame simile, o un match dimostra diminuito affinità di legame per il target di interesse, questo un auspicabile posto per interrompere l'ordinamento. Dopo il round finale, ritorno al punto 1.4.1 arrestarsi ma 1.4.2.

2. FACS analisi dell'ordinamento turni

1. Usando le cellule indotte dal passaggio 1.4.2 per ogni turno di ordinamento, o culture identiche, aggiungere 5 µ l ha indotto le cellule a 25 µ l di ciascuna delle seguenti soluzioni preparate per l'associazione di valutazione (Vedi anche tabella materiali): PBS da solo; PBS con 150 nM YPet Mona (YPet ^12,13; controllo positivo per l'espressione), se disponibile; 900 nM proteina bersaglio coniugata con un colorante fluorescente, come ammina-reattivo colorante con emissione/eccitazione a 493 nm⁄518 nm (Target-488); 900 nM cross-reattivi della proteina target (s) utilizzato per l'ordinamento negativi etichettati con lo stesso colorante fluorescente (interferenti proteina-488); e 900 nM streptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Incubare in ghiaccio per 45 min.
   Nota: Se continuare direttamente dal punto 1.4.2, questo passo sarà sempre essere fatto il giorno dopo il biopanning per quel turno è stata completata perché la libreria selezionata verso il basso era cresciuta durante la notte quindi una subcoltura e indotto il giorno seguente. Possono essere utilizzati anche colture coltivate e indotta Analogamente dagli stock rotondi ordinamento congelati; in tal caso, tutti i turni possono essere testati e confrontati in un singolo esperimento.
2. Centrifugare le cellule a 6.000 x g per 5 min a RT o 4° C. Rimuovere il surnatante e conservare i campioni su ghiaccio.
   Nota: Palline delle cellule possono essere conservati nel ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono pronti per l'analisi.
3. Accendere lo strumento FACS, aprire il software, Start-up del sistema e calibrare strumento seguendo le istruzioni ^{43,44 del produttore}.
4. All'interno del software di FACS, fare clic su "Amministratore" e fare clic sulla cartella desiderata o creare una "nuova cartella". Fare clic su "Nuovo esperimento" icona nella parte superiore sinistra dello schermo. Fare clic destro sull'icona per "rinominare" esperimento. All'interno di quell'esperimento, fare clic su fogli di lavoro"globale".
5. Fare clic sull'icona "Dot Plot", quindi fare clic su foglio di calcolo globale foglio di lavoro per creare questo scatterplot. Cliccare sul puntino complotto grafico stesso, quindi selezionare il "ispettore" icona nella parte superiore a sinistra dello schermo e regolare gli assi al biesponenziale display selezionando le caselle accanto a "Asse Y" e "Asse X" nella finestra aperta. Chiudere la finestra di visualizzazione biesponenziale cliccando sulla X.
6. Creare un "nuovo tubo" facendo clic sull'icona in alto a sinistra dello schermo e rinominare l'esemplare con informazioni appropriate facendo clic destro sull'icona di esemplare sotto "foglio di lavoro globale" e selezionando "Rinomina". Espandere il campione facendo clic sul (+) segno, quindi fare doppio clic sull'icona del filmato, fare clic destro su di esso, e ancora una volta selezionare "Rinomina" per descrivere il campione.
7. Utilizzare questo grafico di stampa di puntino con predefinito SSC-A vs FSC-A per eseguire un campione di controllo negativo in PBS da solo facendo clic su quel tubo doppia o selezionando la freccia accanto a esso. Appena prima di eseguire l'esempio, risospendere il pellet cellulare in 500 µ l ghiaccio freddo FACS con buffer e campione di trasferimento a un FACS tubo (vedere tabella materiali), mescolando bene di pipettaggio e sfogliando il tubo. Posizionare le cellule sedimento del tubo di iniezione del campione (SIT) dello strumento. Premere "acquisire dati" e "Eventi per visualizzare" a 30.000-50.000 e "Eventi per registrare" alla 10.000, portata a basso (per iniziare; aumentare, se necessario) e "Sedersi a filo" selezionato.
   Nota: Velocità appropriata (bassa, media o alta) è la velocità alla quale il numero di eventi/s è approssimativamente fra 200 e 2000.  Utilizzare questo intervallo per tutti i passaggi.
8. Mentre stava acquistando, regolare la soglia di tensione di fotomoltiplicatore (PMT) tubo se necessario selezionando la scheda "Soglia" fare clic su e modificare il "valore". Regolare la tensione per dispersione avanti e laterali (FSC e SSC) tale che le cellule di controllo negativo in PBS solo cadono leggermente sotto il centro.
   Nota: Ulteriori parametri (ad esempio, SSC) possono essere aggiunti nella scheda "Soglia" utilizzando l'icona "Aggiungi". In genere, tensioni PMT di circa 700 V a 1000 v per FSC e SSC funzionano bene per e. coli.
9. Se il campione è leggendo correttamente, regolare la portata per visualizzare eventi 200-2000/s e premere "Record dati". Termine della registrazione, rimuovere il tubo dal SIT e metterli su ghiaccio.  Scegliere l'icona di "Poligono Gate" e utilizzare il mouse per disegnare un cancello intorno alla maggior parte della popolazione cellulare nel scatterplot. Fare clic con il pulsante destro su terreno dot e selezionare "Visualizza gerarchia di popolazione".
10. Utilizzare questa porta "P1" come un padre facendo clic su "P1" nella gerarchia della popolazione. Creare un nuovo grafico di puntino seguendo passo 2.5. Fare clic destro ogni asse e modificare l'asse y per FITC-A e l'asse x a FSC-. Porta il controllo negativo (PBS da solo) utilizzando l'icona "cancello poligono", con il cancello più stretto possibile intorno al lato superiore e sinistro della popolazione.
    Nota: doppio controllo della gerarchia di popolazione per garantire che il cancello di P1 è un genitore del cancello P2. Se non lo è, verrà visualizzata in linea con il cancello di P1 e "Tutti gli eventi" sarà il padre; Elimina il cancello e ricrearlo seguendo il passo 2.10.
11. Selezionare "P2" nella gerarchia della popolazione, fare clic destro e selezionare "Inverti cancello". Fare clic con il pulsante destro sulla trama del puntino con P2 cancello e selezionare "Visualizza popolazioni". Selezionare le popolazioni "P2" e "Non P2" per la visualizzazione (meno dell'1% della popolazione dovrebbe cadere fuori dal cancello).
12. La trama di dot con P2 porta fare clic destro e selezionare "Create Statistiche View". Tasto destro del mouse nella finestra di visualizzazione di statistiche e selezionare "Modifica visualizzazione Statistiche". Fare clic sulla scheda "Popolazioni" e aggiungere o rimuovere popolazioni, come desiderato, compresa la popolazione di genitore, P1 (P2 e non P2 dovrebbe già essere indicato). Fare clic sulla scheda "Statistiche" e aggiungere "FITC-A mediana" e tutte le altre statistiche di interesse. Chiudere la finestra premendo OK.
13. Creare un grafico di trama puntino simile per PE-A vs FSC-A e cancello utilizzando PBS da solo campione (trame precedenti possono essere duplicati e alterati). Utilizzare questo foglio di calcolo per eseguire tutti i campioni (controllo negativo cellule incubate con ogni destinazione fluoroforo comprese) in questo modo, la registrazione di circa 10.000 eventi per ciascuna.
    Nota: Le cellule che cadono fuori dal cancello dopo incubazione con la proteina Target-488, il YPet positivo controllo, ecc, sono leganti a tale proteina, e il valore da "Non PX" (dove X è il numero della popolazione gated per tale grafico) dovrebbe essere registrato come % vincolato. Quando si utilizza SAPE come controllo negativo, usare la trama di FSC-A PE-A vs. L'intensità di fluorescenza media (MFI) di P1 dovrebbe essere registrata anche come questo dà informazioni di là di % di legame, per mostrare il limite dell'associazione in termini relativi ed è più robusto in presenza di valori anomali ⁴⁵. L'intensità di fluorescenza mediano può essere normalizzato (nMFI) dividendo MFI di ciascun peptide dalle IFM di un controllo unico aspetto negativo di impalcatura (con nessun peptide N-terminale), o un clone contenente una sequenza del peptide che non vincola la destinazione di interesse, dopo l'incubazione con la stessa destinazione coniugata con la stessa fluoroforo ¹⁴. Se queste cellule di controllo negativo non sono disponibili, uninduced cellule incubate con la stessa destinazione e identificato con il fluoroforo stesso possono essere utilizzate anche per la normalizzazione.

3. sequenza di analisi dei potenziali candidati e valutazione di affinità di legame

1. Determinazione di sequenza del peptide
   1. Selezionare e sequenza di decine o centinaia di colonie batteriche dal round finale di biopanning (in genere Round 3 e/o 4 sono sufficienti ¹⁴).
   2. Analizzare la sequenza dati utilizzando in particolare il file di macro che abbiamo sviluppato (Vedi informazioni di supporto per il codice, "Sub eCPX_Sequencing") per analizzano le sequenze generate da biopanning la 15mer batterica visualizzazione libreria elencata nella tabella di materiali. Utilizzare il software di foglio di calcolo elencato nella tabella di materiali, o altri software compatibili preferito.
      Nota: Un numero di strumenti è disponibile online che può anche aiutare nel analisi di sequenza del DNA ⁴⁷. Se si preferisce utilizzare un diverso metodo stabilito per l'analisi di sequenza e passare al punto 3.1.3.
      1. Scaricare il set di file di sequenze (file. seq, documenti di testo funzionano anche) ed estrarli in una nuova cartella. Se necessario, spostare o copiare la cartella su disco rigido del computer (in contrapposizione a una cartella di rete) per una maggiore velocità.
      2. Aprire una nuova finestra di foglio di calcolo. Assicurarsi di attivare le macro e attivare tutte le funzioni, se tali messaggi pop-up.
         Nota: I passaggi 3-6 seguito necessario solo essere completato la prima volta che la macro viene utilizzata. Per la successiva analisi, semplicemente "eseguire la Macro" partendo dal punto 7.
      3. Copiare l'intero contenuto della macro nel File "Sub eCPX_Sequencing".
         Nota: La versione corrente è impostata con sequenze per la libreria di 15-mer elencati nella tabella dei materiali di accompagnamento e tradurrà gli aminoacidi tra di loro. Sequenze aggiuntive possono essere inseriti tramite la copia 5' che fiancheggiano sequenze dalla colonna A e 3' che fiancheggiano sequenze nella colonna B del foglio di calcolo, fino a 10 sequenze per ciascuno, prima di eseguire la macro.
      4. Nel file di foglio di calcolo vuoto, selezionare la scheda "Visualizza", quindi fare doppio clic su "Macro". Selezionare la cartella di personal.xlb. Se questo non è disponibile, è possibile registrare una macro prima di far questo apparire.
      5. Fare clic su "creare" o "passaggio in", a seconda di ciò che può essere evidenziato. Incollare l'intera macro nel modulo.
      6. Fare clic su Salva icona o andare su file, Salva. Uscire dal modulo. Se si apre una finestra, premere OK.
      7. Eseguire la Macro: Vai alla cartella dove si trovano i file di desired.seq. Fare clic sulla barra accanto all'icona della cartella nella parte superiore per visualizzare il percorso della cartella. Copiare il file.
      8. Passare alla finestra di foglio di calcolo nuovo. Selezionare la scheda Visualizza, quindi fare doppio clic su macro. Selezionare "eCPX_Sequencing" dall'elenco e fare clic su "Esegui".
      9. Nella finestra che si apre, incolla il percorso del file copiato nel passaggio 7 e premere INVIO. La macro deve iniziare andando attraverso le sequenze e organizzandoli in tabelle su fogli diversi.
      10. Utilizzare il foglio "Riepilogo tabella" per stabilire se sarà necessario controllare i file di traccia per errori e apportare correzioni manualmente (se sequenze contengono "X" o non possono essere tradotto).
          Nota: La "tabella di riepilogo" consente di visualizzare le sequenze peptidiche tradotta, filtrate la sequenza dell'amminoacido (dalla alla Z), a meno che un errore di sequenziamento ha impedito la traduzione. Una "X" indica un singolo aminoacido che non può essere determinato.
   3. Una volta che le sequenze vengono tradotte, organizzato, e correggere eventuali errori di sequenziamento, controllare l'elenco di sequenza del peptide ordinato sul foglio "Riepilogo tabella" per qualsiasi sequenza ripetuta.
   4. Crescere le colture durante la notte per sequenziata colonie di interesse (tra cui le ripetizioni e/o peptidi con evidenti tendenze al minimo) in 5ml LB Cm₂₅ a 37 ° C, agitando a 225 giri/min e salvare gli stock congelatore il giorno successivo in LB contenente glicerolo al 15%, come nel passaggio 1.4.7. testare i peptidi con ripetute sequenze per affinità di legame e specificità utilizzando i metodi di FACS descritti nella sezione 3.3 e utilizzare il formato FASTA dell'elenco di sequenza (la lista completa e ripete solo) per allineare le sequenze utilizzando comodo allineamento e programmi di analisi, come descritto in sezione 3.2.
2. Allineamento di sequenza utilizzando Clustal Omega, Kalign e programmi simili
   1. Copiare sequenze in formato FASTA dal foglio FASTA della macro, o altrimenti creare un elenco di file FASTA delle sequenze da allineare (come quelli dal punto 3.1.3).
      Nota: La colonna A contiene i file FASTA in ordine numerico di "Seq #" mentre la colonna B li Visualizza ordinati per "Sequenza di AA" dal foglio "Riepilogo tabella". L'elenco di sequenze peptidiche filtrate sequenza aminoacidica visualizzerà sequenze inutilizzabile nella parte superiore, come vettore vuoto (come "# vuoto") e quelle sequenze in cui né i 5' o 3' criteri di ricerca sono stati trovati (come "# valore"). Questa funzionalità consente facile aggiornamento o rimozione di quelle sequenze dall'analisi.
   2. Apri Clustal Omega⁴⁸ o Kalign⁴⁹ software accedendo al sito ^50,51, o utilizzare altri software preferito per l'allineamento di sequenza. Copiare e incollare l'elenco di sequenza FASTA e immetterlo nella casella sotto "sequenze in qualsiasi formato supportato". Cambiare "gap aperto pena" a 30 sotto "altre opzioni" in Kalign (questo non è possibile in Clustal Omega), ma in caso contrario, mantenere le impostazioni predefinite prima di cliccare "Invia".
   3. Analizzare l'allineamento di sequenza utilizzando Jalview ^52,53 software direttamente all'interno di Clustal Omega e Kalign software online selezionando la scheda "Riepilogo risultato" sopra l'allineamento e facendo clic sull'icona "Jalview".
      Nota: se si preferisce, o per l'analisi degli allineamenti di sequenza generati da programmi alternativi, Scarica ⁵⁴ il software separatamente e copiare e incollare l'allineamento nella finestra di analisi, che si apre facendo clic su "File", "Input allineamento", e " dalla casella di testo". Questo fornisce un mezzo per determinare facilmente se una sequenza di consenso è presente nell'allineamento di sequenza di input.
3. Confronto tra affinità e specificità utilizzando FACS
   1. Inoculare 5ml LB Cm₂₅ completati con 0,2% w/v D-glucosio con ogni singolo isolato di interesse (da passo 3.1.4 e/o colonie di interesse da ulteriori analisi di sequenza nella sezione 3.2, ecc.) e un appropriato controllo negativo (display impalcatura solo o un peptide che non vincola la destinazione, come descritto nella nota per passo 2.13). Crescere durante la notte a 37 ° C, agitando a 225 giri/min.
   2. Utilizzare le culture durante la notte per inoculare 3 mL LB Cm₂₅ con 60 µ l celle (01:50 diluizione). Incubare a 37° C con agitazione a 225 giri/min fino a quando la cultura raggiunge un OD₆₀₀ di 0,5 - 0.55. Indurre l'espressione di peptidi con 0,04% w/v L-arabinosio plus 2 mM EDTA (per facilitazione del peptide display ⁴²), agitazione a 225 giri/min per 45 min a 37 ° C.
   3. Posto indotto culture sul ghiaccio. Per ogni isolato, aggiungere 5 µ l celle a 25 µ l PBS da solo o PBS contenente: 150 nM YPet ^12,13 (controllo positivo per l'espressione), se disponibile; 250 nM Target-488; 250 nM proteine cross-reattivi-488; e 250 nM SAPE (Vedi 2.1 per maggiori dettagli). Incubare in ghiaccio per 45 min.
   4. Centrifugare le cellule a 6.000 x g per 5 min a RT o 4° C. Rimuovere con attenzione supernatante di prelievo di liquido dalla parte opposta del pellet. Memorizzare le palline delle cellule sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni e sono pronti per l'analisi.
   5. Ogni risospendere le cellule in 500 µ l ghiaccio freddo FACS in esecuzione di tampone, mescolando bene di pipettaggio e sfogliando il tubo, appena prima della lettura utilizzando un citometro a flusso (Vedi tabella dei materiali).
      Nota: Vedere passo 2.13 note per ulteriore spiegazione di gating e calcolo di nMFI per confrontare specificità e affinità di legame. Non-leganti o leganti non specifici possono ora essere rimossi da un'ulteriore analisi, e i raccoglitori di affinità più alti dovrebbero essere valutati nuovamente di allineamento di sequenza che segue la sezione 3.2 a cercare ulteriormente le tendenze che potrebbero essere stato perso nella fase iniziale sequenziato popolazione. Sezioni 3.2 e 3.3 può essere ripetuta secondo necessità come nuove tendenze e sequenze consenso sono notati. Questa analisi può includere sequenze più casuali, se le tendenze non sono visibili.

Risultati

Con l'uso di automatizzati magnetico-attivato delle cellule ordinamento (autoMCS) piuttosto che di ordinamento manuale delle cellule magnetiche, falsi negativi candidati sono significativamente ridotti durante biopanning di esposizione batterica librerie ^9,14. Negativo passaggi di ordinamento può essere anche essere aggiunto come necessario per ridurre i leganti non specifici per il target di interesse, e si suggerisce come minimo per aggiungere una sorta di negativa contro il magnetico perline se stessi davanti. Questa selezione negativa contro i branelli magnetici stessi è stata completata prima di quattro giri di biopanning scelto batterico visualizzano la libreria per leganti l'antigene protettivo (PA), come mostrato nella Figura 2e prima di ulteriori selezione negativa contro rivax e quattro turni di selezione positiva per Elser, come mostrato nella Figura 3. Le perle utilizzate qui sono coniugate a streptavidina per cattura di proteine biotinilate, così non intenzionale isolamento di peptidi associazione a streptavidina stessa è una preoccupazione ed è controllata mediante FACS con streptavidina coniugata a ficoeritrina (Figura 3 , SAPE). Come minimo, associazione di streptavidina dovrebbe essere testato per qualsiasi singoli candidati promettenti nel valutare il legame alla proteina bersaglio. Le percentuali di legame e la nMFI per SAPE dovrebbero essere valori bassi in tutti i turni di ordinamento. Il livello di associazione alla streptavidina può aumentare un po ' con ogni turno ordinamento, come si è presentato in Figura 3, perché la popolazione è esposta ripetutamente per le biglie magnetiche rivestite con streptavidina dopo ogni turno di ordinamento. Se il livello di sfondo streptavidina associazione diventa problematico per analisi a valle, ulteriormente negativo l'ordinamento contro i branelli magnetici potrebbe essere eseguita seguendo il turno di ordinamento positivo in cui la popolazione di associazione di streptavidina è aumentata in al fine di ridurre lo screening a valle di falsi positivi. Quando le proteine o i materiali sono disponibili in particolare che potrebbe interferire con uso a valle del peptide per un'applicazione specifica, o che dovrebbero consentire di cross-reagiscono con i reagenti di affinità per il bersaglio a causa strutturale e/o la somiglianza di sequenza, ulteriormente negativo l'ordinamento contro quella proteina o materiale è raccomandato. Un esempio è l'ordinamento negativo contro rivax prima di isolamento di Elser associazione peptidi, a causa della somiglianza strutturale e l'omologia di sequenza di queste due proteine ^1,15. Ancora una volta, cross-reattivi in associazione a proteine utilizzate per negativo passaggi di ordinamento può essere monitorato durante l'analisi dell'ordinamento turni usando FACS (Figura 3Rivax-488). Nella migliore delle ipotesi, nMFI e percentuali di legame sono bassi, come in questo esempio.

Quando disponibile, un peptide di controllo positivo fisso, ad esempio il peptide P2X al C-terminale dell'impalcatura display prodotto dalla libreria di esposizione batterica utilizzata nei risultati rappresentativi qui, può aiutare a determinare se la mancanza di affinità di legame nell'analisi FACS è a causa della mancanza di espressione del display dell'impalcatura stessa, piuttosto che di mancanza di affinità del peptide per la destinazione. Nella Figura 2 e Figura 3, YPet Mona associazione a questo P2X peptide è monitorato e dimostra che i primi turni di ordinamento esprimono l'impalcatura mal. Questo è probabilmente principalmente dovuto l'alta frequenza di codoni di stop in peptidi N-terminale nella biblioteca casuale, che significa che l'impalcatura stessa non è stata prodotta. Altri effetti possono inoltre contribuire, come la presenza di peptidi con inaspettati effetti tossici per l' e. coli, o diminuita crescita o peptide visualizzazione tariffe per altri motivi (ad esempio mutazioni nel genoma batterico). Aggiunta di EDTA durante l'induzione può migliorare espressione durante questi primi turni di ordinamento ⁴², ma non è stato ancora testato. Associazione a YPet Mona in ogni biopanning popolazione è migliorata significativamente dal 3 ° giro. Confrontando la Figura 2 Figura3, è inoltre evidente che il livello di espressione può essere migliorato aumentando il tempo di induzione a 90 min (come in Figura 2YPet Mona) piuttosto che di 45 min (come in Figura 3YPet Mona) anche se 45 min è in genere sufficiente. Si noti che il nMFI per YPet Mona viene normalizzata a livello di associazione YPet Mona delle cellule del controllo negativo, quindi i valori vicino a 1.0 sono tipici se il livello di espressione è accettabile. Normalizzante YPet Mona MFI per PBS IFM da solo dallo stesso campione è anche un valido modo per confrontare i livelli di espressione relativa, ma dà valori molto più alti (confronta Figura 2 e Figura 3 con deriva da Sarkes et al. 2015 ¹⁵).

Arricchimento della biblioteca per peptidi vincolanti per il target specifico di interesse in genere è raggiunta entro tre turni di ordinamento positivi, ma continuando a un quarto round di ordinamento può essere utile, come illustrato nella Figura 2 e Figura 3 . Qui, per cento associato cellule e nMFI continuano ad aumentare dal 3 ° giro a turno 4 sia per obiettivi di esempio, PA ed Elser, che sono boxed in rosso nella Figura 2 e Figura 3, rispettivamente. Il più alte sequenze peptidiche affinità possono essere già presente nel round 3, ma rischiano di arricchire ulteriormente nel turno 4 pure, che aiuta nella selezione a dei potenziali candidati ¹⁴. L'analisi delle sequenze da giro 4 tende a rivelare sequenze ripetute, e queste ripetute sequenze sono un ottimo punto di partenza per la determinazione di sequenza analisi e consenso affinità e specificità. La macro di eCPX_Sequencing fornita come complemento di questo manoscritto aiuta a semplificare questa analisi iniziale, come illustrato nella Figura 4. Inizio con una cartella di. seq o file di testo, la sequenza di DNA che si trova tra selezionate 5' e 3' sequenze è tradotta, organizzato dalla sequenza dell'amminoacido e analizzato per numero di singoli residui amminoacidici in ogni peptide. L'elenco ordinato di sequenze peptidiche isolato, come mostrato nello screenshot di foglio di riepilogo tabella nella Figura 4, utilizzabile per determinare facilmente quali sequenze ripetere e con quale frequenza. Le cellule in questo foglio di calcolo contenente sequenze ripetute sono delineate in diversi colori per semplificarne l'analisi. Si raccomanda di controllare queste sequenze ripetute per sequenze consenso e altre tendenze. Questo è aiutato dal software di allineamento di sequenza come Kalign e Clustal Omega e analisi può essere eseguita sull'intera sequenza uscita (incluse le sequenze ripetute e non ripetuto alla frequenza che sono apparsi) e l'elenco selezionato giù di ripetizione di sequenze (con o senza loro frequenza relativa). Risultati rappresentativi per PA ed Elser ripetendo sequenze, senza prendere la frequenza in considerazione, sono mostrati in Figura 5A e 5B, rispettivamente. Si noti che nella Figura 5A per il target di PA, molte delle sequenze ripetute singole stessi contengono la sequenza di consenso WFCFTC (o una sequenza simile), sottolineate in rosso, che è stato determinato applicando Jalview software di analisi a un Kalign allineamento di sequenza delle sequenze ripetute. Questo consenso, come WXCFTC, precedentemente è stato determinato per essere un consenso di legante di PA, che fornisce la fiducia nel metodo ordinamento ⁹. In figura 5B, dove sequenze ripetute per la destinazione di Elser sono state analizzate nello stesso modo, il risultato è stato molto diverso. Innanzitutto, c'erano solo cinque sequenze che ripete nel turno 4 di biopanning per leganti Elser, in contrasto con le sequenze ripetute quindici isolate dal 4 ° giro del biopanning per leganti PA (anche se il 44% più colonie inoltre sono stati sequenziati per PA). In secondo luogo, nessuno delle cinque sequenze ripetute conteneva la sequenza più promettente di "consenso" (FWAWF, sottolineati in viola), anche se candidato AX-A15 contenuta la sequenza che meglio abbinato (FWDTWF). Ulteriore analisi, compresa la determinazione di affinità e specificità associazione, hanno contribuita a fornire il consenso di FWDTWF determinato dai primi cinque candidati per l'associazione di Elser in Figura 5, come spiegato di seguito.

Una colonia rappresentanza da ogni sequenza ripetuta può essere ulteriormente analizzata per il cellulare affinità e specificità utilizzando FACS, come in Figura 6A per le sequenze ripetute da biopanning per peptidi associazione Elser. Qui è chiaro che tutte le cinque sequenze ripetute hanno maggiore affinità per Elser, il bersaglio designato, di rivax, la proteina strutturalmente simile utilizzata per l'ordinamento negativo o streptavidina, che è presente durante l'ordinamento dovuto i branelli magnetici utilizzati per biopanning. Ciò è coerente con i risultati già promettenti per affinità e specificità dei turni ordinamento illustrato nella Figura 3, dove è chiaro che arricchimento per l'associazione per la destinazione desiderata, Elser, sta aumentando con ogni giro di biopanning mentre affinità per la proteina simile, rivax, non lo è. Tuttavia, una sequenza di consenso soddisfacente non è stata determinata per ordinamento Elser usando la ripetizione di sequenze da 4 ° giro da solo (figura 5B e sopra discussione). Ritorno alle 100 colonie sequenziate dal 4 ° giro, tuttavia, è stato notato dall'occhio quando alla ricerca di sequenze simili a quella ottimale per il predetto consenso che un candidato ulteriore, AX-A12, conteneva la sequenza FWDTWF che è stata notata in isolare AX-A15 , e che un altro candidato, AX-A14, conteneva una simile sequenza, DWNTWF. Queste e altre sequenze che conteneva somiglianze con le sequenze ripetute, dimostrato somiglianze con altre sequenze non ripetuti o sono stati scelti in modo casuale, sono stati analizzati da FACS per l'associazione di affinità e specificità. Quelli provati sono ordinati in Sarkes et al 2016 ¹ e i top 5 raccoglitori da questa analisi sono mostrati in Figura 6B, con la sequenza di consenso determinata a essere FWDTWF, illustrato nella Figura 5.

Una simile analisi di affinità per la ripetizione di sequenze peptidiche in giro 4 di biopanning per peptidi che riconoscono il bersaglio di PA di legame ha rivelato che i raccoglitori di migliori, come classificati dal rapporto di PA-488 nMFI:SAPE nMFI, contenuto il consenso WXCFTC o un simile sequenza (tabella 1). Usando questo rapporto, le sequenze autorganizzato in quelli che conteneva il consenso e quelli che non hanno fatto. I primi candidati, tutti contenenti sequenze relative al consenso, sono stati analizzati Analogamente ai metodi descritti sopra per Elser in Figura 6, come presentato in Sarkes et al 2015 ¹⁴. Questi risultati dimostrano che per alcuni obiettivi, analisi dei peptidi con ripetute sequenze possono essere sufficiente per ottenere leganti con significative affinità e specificità per un target prescelto e per determinare una sequenza di consenso che può essere, di per sé sufficiente per l'associazione. Si noti, tuttavia, che il numero di ripetizioni non riflette necessariamente l'affinità relativa di legame per il target di interesse (tabella 1). Quando l'analisi di ripetere sequenze da sola non è sufficiente a determinare un modello, è utile per alternare tra l'analisi di sequenza e l'analisi di associazione per restringere il pool di candidati e riesaminare le tendenze tra i candidati con maggiore affinità . Anche quando si osserva una tendenza da analizzare le sequenze ripetute da solo, sequenze aggiuntive non ripetuti possono dimostrare le stesse tendenze, o altre tendenze, dopo ulteriori indagini.

Figura 1: schematico del protocollo biopanning per librerie visualizzazione batterica. Come illustrato qui, librerie di visualizzazione batterica di biopanning è un processo ciclico. Ogni cella nella libreria di esposizione batterica (Vedi tabella materiali) contiene il DNA del plasmide che viene mantenuto fino a quando le cellule sono coltivate in presenza di antibiotico per il quale il plasmide contiene un gene di resistenza (choloramphenicol in questo caso). Ogni plasmide anche codifica per la proteina di impalcatura di visualizzazione che espone un peptide casuale all'esterno della cellula. Poiché ogni cellula deve contenere solo una sequenza di DNA del plasmide singolo, ogni cella deve visualizzare solo un singolo peptide, in più posizioni in tutta la membrana cellulare. A seconda del livello di diversità di libreria all'inizio di biopanning e dopo ogni turno di ordinamento, la sequenza del DNA può o potrebbe non essere univoco da cellula a cellula. Biopanning inizia con la crescita e l'induzione della libreria per visualizzare singoli peptidi sulla loro membrana esterna delle cellule. Questi peptidi possono quindi interagire con una proteina dell'obiettivo (che è biotinilati o altrimenti contrassegnate per la cattura). Per cella magnetico attivato ordinamento (MCS), proteina non legata viene rimosso e le cellule vengono incubate con biglie magnetiche che sono rivestiti con una proteina di cattura (streptavidina in questo esempio, che ha una forte interazione con biotina). Tutta la cultura è quindi esposta a un magnete per separare le cellule associate da cellule non associate. Utilizzando un dispositivo automatico di ordinamento magnetico è preferito per la separazione cellulare per ridurre i falsi positivi. Illustrato qui è una sorta di positiva, in cui vengono conservate le cellule che sono associati a e co-eluire con i branelli magnetici. Per una sorta di negativa, che eseguiamo in genere davanti, il processo è lo stesso tranne per il fatto che le cellule che sono lavate fuori i branelli magnetici vengono invece mantenute. La frazione di biblioteca di interesse, legato (ordinamento positivo) o non associata (ordinamento negativo), è cresciuta durante la notte e utilizzato nel prossimo turno di ordinamento. Ogni giro successivo di biopanning positivo richiede una diminuzione nel volume di concentrazione ed il branello di destinazione per migliorare le condizioni di stringenza. Dopo ogni turno di biopanning, affinità e specificità dei peptidi per il proteina bersaglio vengono valutati mediante fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per aiutare a determinare quando fermarsi biopanning e avviare le indagini singoli candidati. Se necessario, vengono eseguite sequenziamento del DNA e l'analisi di sequenza del peptide. Procedura di analisi può essere di per sé un processo ciclico, in particolare per rivelare tendenze in singoli isolati dopo il round finale di biopanning. A questo punto, le tendenze di sequenza del peptide e/o consenso è correlato con associazione affinità e specificità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: dati di esempio per l'analisi di FACS dell'ordinamento turni: destinazione PA. Affinità, come determinato da FACS obbligatoria viene mostrato dopo 4 giri di biopanning (ordinamento positivo) il batterico selezionato visualizzazione libreria per peptidi vincolante alla destinazione, antigene protettivo (PA). Questo è stato effettuato dopo aver prima eseguito una sorta di negativa contro le biglie magnetiche rivestite con streptavidina. Per la valutazione di associazione, le cellule sono state indotte con 0,4% L-arabinosio per 90 min prima dell'incubazione con soluzioni di controllo e di destinazione e l'analisi di FACS. Market basket analysis per la destinazione desiderata di associazione è boxed in rosso. Qui riportati sono grafici a dispersione di FITC-A vs FSC-A e valori percentuale celle associate (rispetto al controllo negativo gated incubato con PBS da solo) e normalizzato l'intensità di fluorescenza mediano (nMFI, rispetto al controllo negativo privo di peptide incubato con la stessa proteina fluoroforo) delle cellule indotte che sono state incubate per 45 min con: PBS buffer da solo, 150 nM YPet Mona (controllo positivo per l'espressione di peptidi) o 250 nM PA-488 (contrassegnata come destinazione). Si noti l'arricchimento aumentante in affinità per la destinazione di interesse obbligatoria dopo ogni turno di biopanning. A differenza di Figura 3, tutte le separazioni di cella di autoMCS sono state completate utilizzando il programma Posselds. Parte di questi dati possa anche essere visualizzati nei grafici a dispersione di FITC-H vs FSC-H in Sarkes et al 2015 ¹⁴ per il confronto al FITC-A vs FSC-A trame mostrati qui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: dati di esempio per l'analisi di FACS dell'ordinamento turni: destinazione Elser. Allo stesso modo nella figura 2, mostrata qui è affinità di legame comparativa per un esperimento di biopanning completa, come determinato da FACS. La libreria batterica display è stato sottoposto all'ordinamento negativa contro le biglie magnetiche rivestite con streptavidina, come illustrato nella Figura 2, ma è stato poi sottoposto ad un turno aggiuntivo dell'ordinamento negativo contro una proteina omologa con struttura simile e funzione, rivax, prima di eseguire 4 giri di biopanning positivo per i peptidi vincolanti per la destinazione desiderata, Elser. Per la valutazione di associazione, le cellule sono state indotte con 0,4% L-arabinosio per 45 min prima associazione a destinazione, controllo positivo e negativi controlli e leggendo il FACS. Affinità per il bersaglio designato obbligatoria è boxed in rosso. Qui riportati sono grafici a dispersione di FITC-A vs FSC-A (o PE-A vs FSC-A nel caso di SAPE) e i valori per le celle percentuale associato (rispetto al controllo negativo gated incubato con PBS da solo) e nMFI di indotto da cellule che sono state incubate per 45 min con : PBS tampone da solo, 150 nM YPet Mona (controllo positivo per l'espressione di peptidi), 250 nM Elser-488 (con etichetta proteina bersaglio), 250 nM Rivax-488 (contrassegnati potenziali cross-reattivi della proteina dell'obiettivo) o 250 nM SAPE (controllo negativo per il binding diretto a rivestite con streptavidina biglie magnetiche). Si noti l'arricchimento crescente affinità di legame per il target di interesse, Elser, dopo ogni turno di biopanning, e minima affinità per la proteina strutturalmente simile, rivax. In contrasto con la Figura 2, positivo biopanning 1 ° turno è stato effettuato usando il autoMCS programma Posselds mentre successivi turni di ordinamento sono stati completati utilizzando il programma Posseld, come suggerito per biopanning in questo manoscritto. Questi dati possono anche essere visualizzati nei grafici a dispersione di FITC-H vs FSC-H in Sarkes et al 2016 ¹⁵ per il confronto al FITC-A vs FSC-A trame mostrati qui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: analisi di sequenza di esempio output utilizzando la macro "eCPX_Sequencing". Indicato è uno screenshot di 48 colonie sequenziate da 4 round di biopanning la libreria display batteriche selezionate per leganti PA utilizzando il metodo Posselds. Qui viene visualizzato il foglio "Riepilogo tabella". Si noti che le colonie sono state numerate in ordine alfabetico del loro nome di file specificato durante il processo di sequenziazione e che le caselle circostanti sequenze che si ripetono almeno una volta sono descritte in diversi colori per semplificare l'analisi dei dati. La macro eCPX_Sequencing viene fornita come un file di codice supplementare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: sequenza determinazione allineamento e consenso per due bersagli proteici distinti. Tutte le immagini qui riportate sono state generate utilizzando il software Jalview con colorazione di Clustal_X dopo aver allineato le sequenze utilizzando Kalign analisi online software ⁵¹. A) allineamento di ripetere sequenze da PA biopanning turno 4 (corrisponde con la tabella 1). B) allineamento di ripetere sequenze da Elser biopanning turno 4 (corrisponde con Figura 6A). C) l'allineamento dei primi 5 candidati da Elser biopanning turno 4, come determinato mediante analisi Citofluorimetrica dei singoli candidati (corrisponde con Figura 6B). La linea rossa evidenzia la sequenza di consenso in A e C, mentre la linea viola in B sottolinea il precursore per la sequenza di consenso determinato per Elser vincolante quando si esaminano le sequenze ripetute solo, evidenziando il potenziale necessario testare affinità di legame utilizzando FACS prima un consenso può essere determinato in alcuni casi. Allineamenti simili generati con software di analisi differenti possono essere visto in Sarkes et al 2015 ¹⁴ e Sarkes et al 2016 ¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: esempio associazione affinità e specificità per singoli candidati analizzati usando FACS. Qui è illustrata l'intensità della fluorescenza mediano normalizzato (nMFI) determinata utilizzando FACS per sequenze A) ripetute e B) i primi 5 candidati, come determinato da affinità di legame comparativo per la destinazione, Elser, dal 4 ° giro di biopanning. I dati rappresentano la media (barre) e la deviazione standard (barre di errore) di tre esperimenti indipendenti di replica. Si noti che tutti i candidati indicati sono abbastanza specifici per Elser (Elser-488, verde bar) sopra una proteina strutturalmente simile, rivax (Rivax-488, rosso bar) ed il controllo negativo di streptavidina (SAPE, barre nere). Anche se due delle sequenze ripetute in un (AX-07 e AX-15) erano anche tra i primi 5 candidati in B, confronto dei risultati in A e B viene illustrato che analisi di ripetere sequenze da sola non sia sufficiente per isolare il più alta affinità peptidi. Dati qui presentati è stati adattati da Sarkes et al 2016 ¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: rapporto di legame specifico con legame non specifico per singoli candidati ripetere. In questo esempio, il numero di sequenze di ripetizione ed il rapporto di PA (destinazione) nMFI a nMFI SAPE (controllo negativo) è indicati per le sequenze ripetute candidato da PA biopanning 4 ° giro. Questa data era filtrata rapporto relativo di nMFI nMFI:SAPE PA e analizzato per la presenza di consenso WXCFTC noto, o una sequenza simile, che è visualizzata in grassetto e sottolineata. Si noti che le sequenze di auto-organizzano tale che quei candidati con il consenso hanno il più alto rapporto di nMFI nMFI:SAPE PA e quindi interagiscono più specificamente con il bersaglio. I risultati mostrati sono da un singolo esperimento di FACS. Peptidi con affinità più bassa per la destinazione sono stati esclusi dalle analisi che sono stati pubblicati in Sarkes et al 2015 ¹⁴di ulteriori repliche.

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Discussione

Biopanning esposizione batterica librerie è stato un approccio di successo per l'isolamento dei reagenti di affinità, e peptidi offrono un'alternativa utile agli anticorpi per riconoscimento quando criteri specifici sono necessari, come la stabilità in ambienti estremi. Biopanning di queste librerie è stato semplificato utilizzando i metodi di autoMCS descritti qui, e una piattaforma di autoMCS disponibili in commercio si estende questa tecnologia ad un pubblico più ampio. Rispetto ai tradizionali alternati MCS/FACS metodi di ordinamento per batterico visualizzano librerie, metodi di autoMCS sono meno costosi perché non richiedono un investimento in uno strumento più costoso, FACS capace di cernita e di isolare le cellule associate, piuttosto che il tipo del citometro a flusso utilizzato qui, che solo è capace di analisi ¹⁴. I passaggi critici per il successo biopanning di autoMCS includono la separazione programma selezione, negativo l'ordinamento contro potenziali cross-reattivi per ridurre i falsi positivi, arricchimento libreria utilizzando FACS per determinare quando smettere di biopanning, di monitoraggio e analisi intelligente della piscina candidato per evitare la selezione di ingombrante di centinaia di candidati.

Negli esempi descritti nel presente documento viene biopanning successo della libreria display batteriche selezionate per due obiettivi separati, PA ed Elser, anche se con strategie di analisi leggermente diversa a causa delle differenze nelle sequenze del peptide per ciascun pool di candidati dopo quattro turni di biopanning. PA è stato il caso più semplice, con l'analisi di sequenza che dimostrano tendenze chiare dalle sequenze peptidiche che ripetuto almeno una volta in 144 colonie. Questo è stato da solo sufficiente a determinare una sequenza di consenso per la destinazione di PA e quelle colonie che conteneva il consenso o una sequenza simile sono stati i migliori candidati in termini del rapporto di associazione alla PA contro associazione per il controllo negativo di streptavidina. Tuttavia, questo non sarà sempre il caso. Per la destinazione di Elser, 100 colonie sequenziamento ha portato cinque sequenze ripetute, ma la tendenza in queste sequenze era meno chiara, diverso da una tendenza a contenere residui dell'amminoacido aromatico e acido aspartico o asparagina. Il predetto "consenso" delle sequenze ripetute solo potrebbe sono stati prodotto e testato per affinità di Elser, ma poiché nessuna sequenza padre contenuto quella sequenza consenso esatto, siamo tornati alla lista delle colonie sequenziate e osservato che altri candidati che aveva tendenze più in comune tra loro. Infatti, due colonie conteneva una sequenza simile al "consenso" dalle ripetizioni da solo, (FWDTWF invece di FWAWF), che aveva la stessa tendenza dei residui di acido aspartico, fenilalanina e triptofano, ma con diversa spaziatura. Uno di questi peptidi era una sequenza ripetuta, uno non era. Queste due sequenze, insieme a una terza sequenza contenente una variante simile, sono stati tra i primi 5 leganti testati in termini di affinità per Elser. Il raccoglitore superiore generale, AX-A05, visualizzato anche tendenze simili. I risultati per Elser dimostrano che un approccio che alterna diverse volte tra l'analisi di sequenza e l'analisi di affinità e specificità a volte sarà necessario, a seconda della destinazione scelta. I risultati per la destinazione di Elser dimostrano anche il livello di specificità che possono essere raggiunti nel corso di una proteina molto simile (rivax ^1,15).

I programmi di autoMCS selezionati per i nostri studi sono stati Posselds e Posseld, entrambi per selezione positiva delle cellule bersaglio con etichetta con bassa frequenza, a meno di 5% della popolazione iniziale. In entrambi i casi, le cellule passano attraverso due colonne magnetiche. Nel caso del programma di Posselds, tuttavia, le cellule passano più lentamente attraverso la prima colonna per aumentare l'esposizione tempo ⁴¹. Oltre alle descrizioni programma fornite dal produttore del dispositivo commerciale autoMCS (Vedi Materiali tavolo) ⁴¹, questi programmi sono stati scelti dopo un iniziale confronto di diversi programmi di potenziale. Capacità di ogni programma per evitare di tirare fuori falsi positivi da una cultura omogenea delle cellule di controllo negativo e di isolare con successo un noto raccoglitore ad un target di interesse da una coltura mista che contiene le cellule di controllo negativo addizionate con una diminuzione percentuale di legante noto, sono stati confrontati. Se si discosti significativamente dalle applicazioni descritte qui, un simile confronto potrebbe essere utile nella selezione del programma per la nuova applicazione. Tuttavia, precedentemente pubblicato risultati confrontando questi due programmi (Posseld e Posselds) per l'isolamento dei peptidi affinità reagenti per PA hanno mostrato che utilizzando uno di questi programmi per tutti i quattro giri di biopanning ha condotto all'isolamento di peptidi con simili affinità e specificità per la PA e la determinazione del consenso WXCFTC. Le differenze principali sono stati quello Posseld, con il suo tasso di flusso più veloce, ordinato più rapidamente e affinità per la destinazione obbligatoria di conseguenza era più alto dopo solo due giri di biopanning, mentre usando il Posselds portato a ulteriori sequenze uniche dopo quattro turni di biopanning ¹⁴. imparare da questo, la strategia è stata cambiata leggermente quando biopanning per peptidi associazione Elser incorporare entrambi i benefici: Posselds è stato utilizzato per giro 1 per consentire più tempo di esposizione durante questo passaggio critico dove la diversità è più alto, ma poi la programma è stato commutato a Posseld per l'isolamento più veloce dei leganti affinità più alti durante i giri 2-4 ^1,15. Questo sembrava essere ideale per Elser, soprattutto perché il nMFI e le percentuali di legame erano entrambe più alto per Elser ordinamento giro 4 rispetto al PA ordinamento round 4 con entrambi i programmi (Figura 2 e Figura 3 e Sarkes et al 2015 ¹⁴), ma un confronto diretto, utilizzando una strategia contro l'altro con la stessa destinazione sarebbe richiesto per un confronto più conclusivo. Quale programma è meglio per una particolare applicazione può dipendere l'obiettivo individuale, la libreria di ordinamento utilizzata e il livello di espressione di peptidi che si ottiene con qualsiasi variazione delle condizioni qui descritte.

Non discusse qui sono risultati potenziali da biopanning con materiali abiotici, ma abbiamo anche usato la stessa libreria di esposizione batterica per biopanning contro massa alluminio ². Questo studio non è stato eseguito utilizzando autoMCS, ma studi simili potrebbero essere compiuti utilizzando autoMCS se il materiale è disponibile su, o potrebbe essere rivestito su o coniugato a, magnetic beads. Nello studio alluminio alla rinfusa, struttura secondaria modellazione e analisi individuale dell'amminoacido era utile per capire che cosa stava guidando l'affinità di legame dei peptidi isolati, poiché nessuna sequenza di consenso era determinato ². Anche con bersagli biologici, questo può essere necessario per comprendere ciò che sta guidando l'affinità di legame per alcune destinazioni, motivo per cui il foglio di lavoro generato dalla macro "eCPX_Sequencing" include una scheda con analisi di frequenza dei residui individuali. Se nessuna sequenza ripetuta è visto oltre alla mancanza di un consenso, e frequenza di residuo non mostra nessun modello, tuttavia, altri tipi di analisi possono essere richiesti. Inoltre, ulteriore ordinamento giri potrebbe essere necessario evitare lo screening di un numero molto maggiore di candidati per la down-selezione di quelli con affinità sufficienti per la destinazione desiderata.

Con la crescente disponibilità di sequenziamento di nuova generazione, uno studio più approfondito potesse essere eseguito per determinare i candidati più promettenti prima del test di affinità e a determinare il grado di arricchimento dopo ogni turno di biopanning. Tuttavia, sequenze di passare alla fase di analisi associazione potrebbero essere necessario essere ricreati per clonazione, se non sono abbastanza alta frequenza per isolare facilmente con sequenziamento sistematico Colonia di decine o centinaia di colonie. Come la tecnologia avanza, diventando meno costosi e più sistematico, e soprattutto con un'opzione per l'isolamento di Colonia, sarà probabilmente essere il modo migliore per analizzare i dati biopanning. Può portare alla delucidazione delle sequenze modo individuale e l'intera libreria, evolvere. Inoltre, i batteri nella libreria di ordinamento possono mutare nel tempo, che potrebbe influenzare ordinamento verso le cellule con tassi di crescita più veloce o batteri che iperesprimono genomici proteine capaci di legare un materiale anche senza visualizzazione dell'impalcatura e peptide espressione, per istanza. Per questo motivo, una volta candidati promettenti emergono, vale la pena di isolare il DNA del plasmide, retransforming fresco e. coli e confermando il legame del peptide via FACS. Se si prevede di utilizzare il peptide in un formato senza cellula, affinità anche dovrebbero essere valutati per il peptide gratis. Ad esempio, i reagenti di affinità del peptide scoperti attraverso display batterica per la destinazione SEB erano prodotta sinteticamente off-cellula ed analizzati con metodi più tradizionali quali analisi enzima-collegata metologie (ELISA) e il cellulare (via FACS) e fuori delle cellule (via ELISA) affinità sono stati confrontati usando_{il dalul K determinato da entrambi metodi ⁷}.

Anche se la forza dell'interazione biotina-streptavidina rende una strategia ideale per l'acquisizione del bersaglio di proteine e peptidi associati, questa procedura può essere modificata per altre strategie di acquisizione. Accoppiamento diretto della proteina a biglie magnetiche, come la resina epossidica e perle di acido carbossilico, ha avuto successo e rimuove un passaggio di associazione. Tuttavia, il collegamento diretto può ostacolare potenziali siti di legame in un modo specifico o non specifico, a seconda della strategia di attacco. Un ulteriore vantaggio a usando le perle di streptavidina è che meno stabile della proteina target può essere appena biotinilati in 30 min o memorizzati congelati, se necessario, mentre le perline se stessi tendono a richiedere più lunga incubazione con la proteina per cross-linking e sono generalmente conservato a 2-8° C. La concentrazione di partenza suggerita di proteine biotinilate target qui, 600 nM, ha avuto successo per bersagli multipli, ma potrebbe essere possibile isolare i reagenti di cattura del peptide con affinità aumentata se questa concentrazione è ridotta. Inoltre, questo metodo può essere esteso a e modificato per altre librerie di esposizione batterica ed altri organismi. Ad esempio, questi passaggi possono essere eseguiti in assenza di ossigeno per uso con gli anaerobi, o in altri ambienti per l'utilizzo con extremophiles per isolare i peptidi con proprietà uniche. I peptidi e/o consenso determinato per una particolare destinazione di interesse può essere potenzialmente utilizzato il cellulare come una vita materiale, o prodotta sinteticamente off-cellula. Peptidi prodotte sinteticamente possono essere ulteriormente regolate per lo sviluppo di maggiore affinità e agenti di proteina catalizzata Capture (PCC) più robusti per l'uso in sensori, o per altre applicazioni in cui gli anticorpi sarebbero stati utilizzati in genere per l'associazione o riconoscimento ^38,55. Modellistica molecolare è utilizzabile anche per aiutare a determinare vincolante posizione del peptide con il suo obiettivo, come recentemente è stato effettuato per i peptidi associazione Elser e consenso elencati nella Figura 5 ¹. Nel complesso, biopanning esposizione batterica librerie per i reagenti peptide affinità è un'alternativa veloce, semplice e potente per la produzione di anticorpi per il riconoscimento e la rilevazione di bersagli proteici e questo semi-automatico biopanning approccio ha prodotto risultati affidabili con applicazioni di vasta portata.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545	Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB)	Fisher Scientific	BP1426-500	Growth medium
Chloramphenicol	Fisher BioReagents	BP904-100	Antibiotic
Agar	Fisher Scientific	BP2641-500	Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library	Cytomx Therapeutics	N/A; http://cytomx.com/contact/	On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose	Sigma	A3256-500G	Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)	Amresco	0780-10L	Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh	Thermo Scientific	PI21327	Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit	Thermo Scientific	PI28005	Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads	Invitrogen	65601	Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G	Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose	Sigma	G8270-1KG	Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona	UCSB and ARL	N/A	Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester	Thermo Scientific	46403	For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)	Thermo Scientific	S866	Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow	Becton, Dickinson, and Company	342003	Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns	Miltenyi Biotech	130-021-101	For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	Miltenyi Biotech	130-091-221	For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution	Miltenyi Biotech	130-092-987	For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol	VWR	E505-4L	Decontamination of autoMACS
Glycerol	Sigma	G6279-1L	For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack	Miltenyi Biotec	130-092-952	For MACS Separation
BD FACSCanto II	Becton, Dickinson, and Company	744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview	For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software	Becton, Dickinson, and Company	659523	For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator	Thermo Scientific	A13346	Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing	Genewiz	N/A; https://www.genewiz.com/	DNA and Colony Sequencing Services
Excel	Microsoft	323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400	For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA)	List Biological Laboratories, Inc.	171	Target protein used as example for representative results.
Abrax	ECBC and ARL	N/A	Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax	ECBC and ARL	N/A	Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.