Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Riepilogo

Qui, un metodo è descritto per la preparazione di co-coltura 3-dimensionale della sferoide (3D) delle cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti, seguiti dalla misura delle funzioni metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Abstract

Molti tipi di cancro, tra cui il cancro del pancreas, hanno uno stroma fibrotico denso che svolge un ruolo importante nella progressione del tumore e l'invasione. Fibroblasti attivati cancro associato sono una componente fondamentale dello stroma del tumore che interagiscono con le cellule tumorali e sostenere la loro crescita e sopravvivenza. Modelli che ricapitolano l'interazione delle cellule tumorali e attivato fibroblasti sono strumenti importanti per studiare la biologia stromal e per lo sviluppo di agenti antitumorali. Qui, un metodo è descritto per la generazione rapida di co-coltura robusto sferoide 3-dimensionale (3D) delle cellule del tumore pancreatico e fibroblasti attivati del pancreas che possono essere utilizzati per successivi studi biologici. Inoltre, descritto è l'uso di sferoidi 3D nello svolgimento delle analisi funzionali metaboliche per sondare le vie di bioenergetica cellulare utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare accoppiato con una micropiastra sferoide. Le cellule di cancro del pancreas (Patu8902) e le cellule del fibroblasto pancreatici attivati (PS1) sono state co-coltivate e magnetizzato utilizzando un assembly di nanoparticella biocompatibile. Magnetizzato cellule erano rapidamente bioprinted utilizzando unità magnetiche in un formato ben 96, in crescita media per generare sferoidi con un diametro che varia tra i 400-600 µm entro 5-7 giorni di cultura. Analisi metaboliche funzionali utilizzando Patu8902-PS1 sferoidi poi venivano realizzate utilizzando la tecnologia di flusso extracellulare per sonda vie energetiche cellulari. Il metodo qui è semplice, permette la generazione costante di cancro cellula-fibroblasto sferoide co-colture e può essere potenzialmente adattato per altri tipi di cellule di cancro all'ottimizzazione della metodologia descritta corrente.

Introduzione

Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati numerosi modelli 3D in vitro per ricapitolare e per studiare in vivo del tumore biologia, microambiente e crescita condizioni di cancro cellule^1,2. Coltura sistemi con un'esposizione uniforme agli fattori biochimici e composti in fase di sperimentazione non riescono a replicare le interazioni tumore-stroma 3D native esposte a una sfumatura di composti attraverso l'extracellulare di cellule dello strato monomolecolare di bidimensionale (2D) matrice proteine (ECM)^3,4. Così, rispetto ai modelli 2D coltura tissutale, cancro 3D modelli sono emerso per mostrare meglio il potenziale a simulare il microambiente tumorale e servito come strumenti importanti per meglio comprendere in vivo le caratteristiche del tumore, quali ipossia, il desmoplasia, dormienza, penetranza di droga, tossicità e resistenza terapeutica^5,6. A tal fine, modelli 3D hanno il potenziale di colmare il divario tra coltura cellulare 2D e modelli animale intero imitando in vivo caratteristiche del tumore, pur essendo relativamente poco costoso e ottimizzato per la generazione rapida e coerenza. Questi vantaggi vengono sfruttati per accelerare la ricerca traslazionale in molti settori tra cui biologia del cancro, morfogenesi e^7,8di ingegneria tissutale.

In un impeto di evoluzione di metodi di coltura del tessuto 3D, tecniche di levitazione magnetica hanno recentemente sviluppati e descritti per la crescita, analizzante e imaging di sferoidi derivati da varie cellule tipi^{9,10, 11 , 12}. magnetico 3D multimateriali sfrutta l'uso di forze magnetiche di ingegnere tessuti da cellule con nanoparticelle biocompatibile di magnetizzazione e stamparle in formati multi-pozzetto. Questo consente la rapida produzione di coerente, vicino identici sferoidi 3D, che possono essere sfruttate e utilizzate per una pletora di applicazioni a valle per indagini biochimiche e biofisiche¹⁰. Qui abbiamo adattato la tecnica multimateriali magnetica utilizzando un materiale biocompatibile chiamato Nanoshuttle (NS) è composta da ossido di ferro, poli L-lisina e oro nano particelle per etichettare i fibroblasti e le cellule di cancro del pancreas. NS attribuisce elettrostaticamente alla membrana del plasma, non è noto da associare a qualsiasi specifici recettori, e uscite fuori la cella in superficie entro una settimana. Richiede forze magnetiche molto basse (30pN), abbastanza per aggregato, ma non danno delle cellule e non influisce l'attuabilità delle cellule, il metabolismo o proliferazione per renderlo estremamente biocompatibile per culture 3D^{10,13,14 ,15}.

In questo studio, utilizzando il cancro del pancreas come esempio e modello, descriviamo la generazione e l'analisi metabolica di sferoidi cellulare-fibroblasto cancro 3D. A partire da cellule coltivate in vasi 2D, illustriamo le condizioni di cultura e di crescita di sferoidi di co-coltura di tumore pancreatico-fibroblasto utilizzando multimateriali magnetico. Sferoidi coltivate sono stati poi utilizzati in analisi metaboliche funzionali utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare, una tecnologia dimostrato misurare simultaneamente i due percorsi di produzione energetici principali, la glicolisi e la respirazione mitocondriale, in una varietà di live cellule e tessuti^{16,17,18,19,20}. La glicolisi è stata misurata come una variazione nel tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), mentre la respirazione mitocondriale o fosforilazione ossidativa è stata misurata come tasso di consumo di ossigeno (OCR). Proponiamo che questo metodo sviluppato per sferoidi di tumore pancreatico può servire come una dorsale per ottimizzazione e traduzione 3D tumore sferoide generazione e analisi di altri tipi di tessuto e delle cellule.

Protocollo

1. cultura del cancro del pancreas sferoidi 3D utilizzando multimateriali magnetico

1. Using standard asettica tessuto cultura tecnica, cultura cellule di interesse in una boccetta di T75 ad una confluenza di 70-80% in media di crescita appropriata.
   Nota: In genere, 5-7 × 10 ⁶ cellule da una boccetta T75 confluente di 70-80% sono state raccolte. Due tipi differenti delle cellule sono stati utilizzati in questo studio - Patu8902 (le cellule del tumore del pancreas) e PS1 cellule (cellule stellari pancreatiche attivate ²¹). Entrambe le linee cellulari sono state coltivate in Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) completati con 10% (v/v) fetale bovino serum(FBS), 1 × penicillina-streptomicina (p/s).
2. Lavare le cellule una volta con 5 mL di Dulbecco ' tampone fosfato s saline(DPBS).
3. Cellule di scollegamento da plastica di superficie da trypsinizing con 2 mL di 0.05% tripsina-EDTA per 5-10 min a 37 ° C. Check per distacco cellulare sotto un microscopio.
4. Disattiva tripsina da aggiunta di media di crescita di 8 mL per indipendente celle. Evitare sopra trypsinization, in quanto questo può influenzare negativamente la salute/vitalità delle cellule.
5. Cellule pipet su e giù per generare una sospensione unicellulare e conteggio delle cellule densità utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro.
6. Nel frattempo, portate un flaconcino di NS a temperatura ambiente.
7. Calcolare la quantità di cellule necessarie per la semina il numero desiderato di sferoidi (pozzi) e aliquota ad un nuovo tubo conico da 15 mL. Ad esempio, al seme di un intero 96 ben piatto con 5.000 cellule/pozzetto, cellule ⁵ aliquota almeno 5.5 × 10.
8. Raccogliere cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 3 min attentamente aspirare o decantare il supernatante e risospendere le cellule ad una concentrazione di 1,0 x 10 ⁶ cellule/mL in media di crescita. Pipettare delicatamente utilizzando un puntale ampia annoiato per evitare di tosatura. Ad esempio, risospendere 5.5 x 10 ⁵ celle in 550 µ l di crescita media.
9. Magnetizzare la quantità desiderata di celle utilizzando il NS equilibrato (punto 1.6).
   1. Direttamente aggiungere NS alla sospensione di cellule in coltura e agitare delicatamente. Per le etichette magnetiche efficiente di celle, utilizzare 10 µ l NS per 100 µ l cellule (risospese a 1 x 10 ⁶ cellule/mL).
      Nota: Per un tipico esperimento, etichetta 5.5 × 10 ⁵ Patu8902 cells in 550 µ l con 55 µ l NS e 1.1 × 10 ⁶ PS1 in 1100 µ l, (separatamente) con 110 µ l NS.
   2. Delicatamente Inverti tubo un paio di volte per garantire la sospensione cellulare. Provvedere al trasferimento temporaneo, il mix di cella-NS in un unico pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Farlo separatamente per ogni tipo di cellula di essere magnetizzato. Piastra di copertura e incubare le cellule a temperatura ambiente per 2 h con agitazione delicata per consentire l'associazione di NS alla superficie delle cellule.
      Nota: Cultura e dosaggio di sferoidi a partire sia da Patu8902 o PS1 celle da solo, oltre a sferoidi di co-coltura a partire con entrambi tipi premiscelati prima stampa su dischi magnetici con successo è stato ottenuto utilizzando questo metodo in indipendente delle cellule esperimenti. Un metodo per la generazione di sferoidi di co-coltura dalle cellule Patu8902 e PS2 è descritto di seguito nei passaggi successivi.
10. Pipet su e giù per le cellule magnetizzate delicatamente per mescolare in modo uniforme e preparare un mix master contenente il numero di cella desiderata. Per il seeding sferoidi, utilizzare un totale di 15.000 celle (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) e regolare per un volume totale di 150 µ l per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
    Nota: Il volume finale erogato in ogni pozzetto deve essere lo stesso indipendentemente dal numero di celle utilizzate.
11. Mettere una piastra a 96 pozzetti cella repellente in cima l'unità sferoide magnetico 96 pozzetti e dispensare 150 µ l di mix di celle in ogni pozzetto. Osservare le cellule lentamente raccogliere al centro del pozzo sopra il magnete. Coprire e incubare la piastra durante la notte in un incubatore a CO ₂ 5% impostato a 37 ° C con il disco magnetico sferoide ancora collegato. Rimuovere il disco magnetico e incubare per un'ulteriore crescita fino a 7 giorni.
    Nota: È fondamentale usare cartilagini di accrescimento delle cellule repellente per la stampa di sferoide utilizzando unità magnetica sferoide. Assicurarsi che venga utilizzato l'unità sferoide con magneti più piccoli più sottile, non l'unità di detenzione.
12. Monitorare la crescita di sferoidi ogni giorno. Ricostituire con media crescita fresco ogni tre giorni inserendo la piastra di crescita montata sul magnetico che tiene in auto ad un angolo e utilizzando una pipetta multicanale per disegnare fuori esaurito media.
    Nota: Patu8902 e PS1 cellule co-seminate ad 15.000 cellule/pozzetto cresceranno in 3D sferoidi con un diametro di 400-600 µm entro 5-7 giorni. A questo punto sono pronti per caratterizzazione metabolica, valutazione di droga e altre applicazioni a valle sferoidi.

2. Analisi metabolica di sferoidi di tumore pancreatico 3D per le vie di bioenergetica utilizzando l'analizzatore Flux extracellulare

Nota: In questa sezione, l'analisi delle funzioni metaboliche di sferoidi utilizzando un flusso extracellulare analizzatore con dosaggio micropiastre specificamente progettate per 3D sferoidi è descritta.

1. Lavaggio e trasferimento di sferoidi da placche di crescita a sferoide dosaggio micropiastre.
   Nota: Sferoidi possono essere utilizzati per analisi metaboliche quando raggiungono un diametro di ~ 500 µm.
   1. Il giorno prima dell'esecuzione del saggio, idratare la cartuccia sensore o sonda con dosaggio calibratore (200 µ l/pozzetto) nella piastra di utilità fornito e incubare pernottamento (4-18 h) in un incubatore (non-CO ₂) fissato a 37 ° C.
   2. Preparare medium di analisi appropriato per il dosaggio desiderato metabolico integrando il supporto di base (vedere la tabella materiali) o dosaggio di 2 mM L-Glutammina per test di stress di glicolisi (GST) o con piruvato di 1 mM, 2 mM L-Glutammina e 10 mM glucosio per un l'analisi mitocondriale stress test (MST).
      Nota: L'analizzatore di flusso extracellulare misura sia la respirazione mitocondriale (OCR) e glicolisi (ECAR) di cellule vive in un formato di piastra a 96 pozzetti. Questi tassi di fornire una panoramica della funzione metabolica cellulare nei campioni in esame. Consultare il manuale nei corredi di analisi per istruzioni dettagliate.
   3. Dopo l'aggiunta di dosaggio integratori specifici (si veda il punto 2.1.1), scaldare il medium di analisi completati in bagnomaria a 37 ° C e regolare il pH a 7,4 ± 0,1 con 0.1N NaOH. Mantenere il mezzo caldo fino all'uso.
   4. Ricostituire dosaggio reagenti del kit a medio dosaggio calibrato e consigliate concentrazioni stock.
      Nota: Questi sono fatti a 10 × la concentrazione finale desiderata nei pozzetti. Le concentrazioni d'archivio per glucosio, oligomycin e 2-deossi-glucosio (2DG) sono 100, 100 µM e 500 mM, rispettivamente.
   5. Osservare sferoidi nella piastra di crescita sotto una luce microscopio per controllare per morfologia sferoide e uniformità generale; in termini di forma e strutturae di sferoidi.
   6. Trasferire la piastra di crescita su un disco magnetico della holding e aspirare accuratamente supporti di crescita di ~ 120 µ l. Delicatamente lavare sferoidi con ~ 120 µ l di media analisi riscaldato e pre-calibrato, aspirare e ripetere il lavaggio due volte. Ispezionare le sferoidi sotto il microscopio nuovamente per garantire che non sono mondati sferoidi.
   7. Preparare la micropiastra dosaggio sferoide aggiungendo media di dosaggio caldo 180 µ l a ciascun pozzetto.
   8. Impostare una micropipetta P20 a 10 µ l e forma una punta larga annoiata ad esso. Se largo annoiati suggerimenti non sono disponibili, tagliare le punte dei puntali regolari con un pulito forbici o bisturi per allargare il foro.
      Nota: Questo dovrebbe ridurre tosatura e preservare la morfologia complessiva di sferoidi durante il trasferimento per dosaggio piastre.
   9. Utilizzare una superficie calda (37 ° C) di effettuare trasferimento di sferoidi. Utilizzare una superficie di Visualizzatore pellicola di raggi x scaldata con una lampada a luce bianca per migliorare il contrasto e visualizzazione di sferoidi durante il processo di trasferimento di aiuti.
   10. Attentamente aspirato un singolo pre-lavato sferoide dalla piastra di crescita cellulare repellente utilizzando una micropipetta P20 dotato di un ampio foro punta e delicatamente sferoide di trasferimento direttamente nel centro di ciascun pozzetto di una piastra di dosaggio sferoide per svolgere il metabolico test. Consentire ogni sferoide dolcemente cadere in micro-camera centrale di ciascun pozzetto per gravità pura per popolare la piastra dosaggio.
       Nota: Richiede solitamente 5-8 s per ogni sferoide a cadere verso il centro del pozzo di gravità. Non estrarre la pipetta fino a quando le sferoidi si sono stabiliti nella micro-camera. Fare non il deposito sferoidi nei pozzetti della piastra assay (A1, A12, H1, H12) poiché questi 4 angolo verrà utilizzato come pozzi sfondo.
   11. Monitorare la morfologia e la posizione di ogni sferoide per garantire che ogni sferoide è al centro di ciascun pozzetto. Se necessario, riposiziona al centro del pozzo aspirando fuori sferoide utilizzando un ampio foro puntale e successiva deposizione dalla forza di gravità.
   12. Una volta che sono stati trasferiti tutti gli sferoidi, posizionare la piastra di dosaggio in un incubatore a 37 ° C aria umidificata (non-CO ₂) per prima un'ora del test.
2. Cartuccia sensore con composti e dell'eseguimento del test di carico
   1. preparare 10 × concentrato specifici reagenti nei media specifico dosaggio descritto al punto 2.1.2. Ad esempio, per eseguire GST, ricostituire il glucosio, oligomycin e 2-DG in volumi consigliati cui il manuale di analisi. Analisi GST e di MST sono state effettuate utilizzando Patu8902-PS1 sferoidi.
   2. Correttamente orientare la cartuccia sensore con righe etichettate A-H sul lato sinistro e posizionare una guida di caricamento sopra la cartuccia sensore. Garantire il corretto caricamento della porta desiderata orientando la Guida di carico affinché la lettera corrispondente alla porta per essere caricato è all'angolo superiore sinistro.
   3. Usando una pipetta multicanale, dispensare i reagenti direttamente nei porti di iniezione. Tenere carico guide in posizione utilizzando la punta delle dita durante l'intera procedura.
      Nota: Ciascun reagente verrà iniettato in una porta consigliata di cui il manuale di analisi. Evitare la creazione di bolle d'aria, ma non toccare qualsiasi parte della cartuccia per rimuovere le bolle d'aria.
   4. Rimuovere caricamento Guida e posizione al livello degli occhi con cartuccia per ispezionare visivamente porte di iniezione per il caricamento anche.
   5. Creare il protocollo di design/strumento di analisi sperimentale utilizzando il controller di strumento software Wave (d'ora in poi, software di analisi), come descritto nella sezione 2.3.
3. Analisi progettazione e l'esecuzione utilizzando il software di analisi
   1. Crea un modello di analisi per l'esperimento
      1. aprire il software di analisi e fare clic su " modelli " o scegliere da un test esistente modello. Fare doppio clic su " modello vuoto ".
      2. Definire gruppi sperimentali e condizioni.
         1. Strategie di iniezione di definire per le porte A, B e C. lasciare vuoto di porta D.
            Nota: Per l'analisi di GST, solo queste porte verranno caricate con glucosio, Oligomycin e 2-DG. In caso di analisi di MST, verrà caricati oligomycin, FCCP e rotenone.
         2. Pre-trattamenti definire se sferoidi sono stati trattati con uno o più composti di prova e il gruppo di controllo. Definire il supporto di analisi per includere la sorgente, supplementi e altre informazioni.
         3. Definire uno o più celle tipo (ad es. Patu8902, PS1) vedendo le informazioni sul numeri di densità e passaggio.
      3. Clic " generare gruppi di ".
      4. Clic " piastra mappa " scheda e assegnare gruppi alla piastra dosaggio corrispondente al disegno sperimentale.
      5. Selezionare i pozzi di quattro angoli come pozzi di sfondo. Assicurarsi che non siano nessun sferoidi in questi pozzetti.
4. Eseguire analisi sull'analizzatore
   1. scegliere la scheda protocollo strumento mantenere l'impostazione predefinita i comandi del protocollo controllando " Calibra ", " equilibrato " e " ciclo di misurazione Baseline ".
   2. Clic " iniezioni " e definire composto per ogni porta. Modificare i cicli di misura a 6 cicli dal valore predefinito 3 cicli per sferoidi. Mantenere l'impostazione predefinita 3 min mix, 0 min attesa e volte misura 3 min.
      Nota: Orario di mix-attesa-misura predefinito è 0 min, 3 min, 3 min, rispettivamente. Tre tasso basale misurazioni vengono effettuate in genere prima dell'iniezione del primo dosaggio di composto. Queste misurazioni possono essere calibrate e riadattate come per il disegno sperimentale.
   3. Revisione protocollo e gruppo sintesi.
   4. Salva modello struttura test.
   5. Procedere alla calibrazione del pre-dosaggio una volta porti di iniezione sono state caricate con substrati di dosaggio. Trasferire la cartuccia con la piastra di utilità per l'analizzatore di flusso extracellulare.
      Nota: Questo di solito viene completata entro 15-20 min e calibra i sensori per eseguire misurazioni di OCR ed ECAR.
   6. Dopo la taratura della cartuccia, riposizionare la piastra di utilità con la piastra di test pre-riscaldato contenente 3D sferoidi e avviare il test. Dopo aver completate le misurazioni, è possibile esportare i dati in fogli di calcolo o software grafico e statistico per analizzare i dati.

Risultati

Il flusso di lavoro generale per l'analisi di flusso extracellulare di sferoidi 3D e multimateriali magnetico
Figura 1 illustra una panoramica dell'intero processo descritto in questo protocollo. Le cellule di cancro del pancreas (Patu8902) e le cellule stellate attivate (PS1) sono state coltivate in coltura tissutale recipienti contenenti la media di crescita appropriata a una confluenza di 70-80%. Le cellule sono state distaccate dalla nave di cultura 2D e lavato, densità delle cellule è stata determinata e cellule infine risospese nel media di crescita presso 1 × 10⁶ cellule/mL. NS, un assembly di nanoparticella costituito da oro, ossido di ferro e poli-L-lisina è stato utilizzato per magnetizzare le cellule. Cellule Patu8902 e PS1 individualmente magnetizzate erano poi mescolate e stampate sulla crescita cellulare repellente 96 pozzetti piastre montate su un disco magnetico sferoide. Abbiamo ottimizzato i 15.000 per essere il numero totale di cellule per il seeding di un singolo pozzo (5.000 Patu8902 cellule miscelati con 10.000 PS1 cellule per generare un singolo sferoide). Dopo incubazione in condizioni di coltura del tessuto appropriato per 5-7 giorni, 3-dimensionale sferoidi sono stati ottenuti, durante i quali la crescita di questi sferoidi era monitorata e registrata. Dopo il lavaggio con media di dosaggio, sferoidi erano fisicamente trasferiti su una micropiastra sferoide di svolgere analisi metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare per la misura simultanea di glicolisi e respirazione mitocondriale.

Cultura e crescita di sferoidi di tumore pancreatico-fibroblasto
Per ottenere sferoidi funzionale e robusti, la cellula tumorale epiteliale linea Patu8902 e attivato le cellule stellate PS1 sono state coltivate in RPMI-1640 completati con siero fetale bovino. Pat8902 e cellule di PS1 magnetizzate con NS erano poi mescolate in un rapporto di 1:2, in modo da un totale di 15.000 cellule per pozzetto di una piastra di crescita del seme. All'interno di 24 h di stampa le celle sui dischi magnetici, cellule focalizzato al centro del pozzo esattamente sulla cima di ogni perno magnetico sotto ciascun pozzetto. Crescita di sferoidi Patu8902-PS1 è stata monitorata da formazione immagine nei giorni 2, 4, 7 e 9 dopo la semina di cellule. La figura 2 Mostra la quantificazione del diametro medio di sferoidi rappresentativi a vari intervalli di tempo sopra. Il diametro di sferoidi aumenta da 414 µm giorno 2 a 596 µm il giorno 7 post stampa. Non c'era differenza significativa tra la crescita nei giorni 7 e 9, e così tutti gli altri la sperimentazione era limitata a 7 giorni di crescita della sferoide. Abbiamo notato che le sferoidi acquisiscono una morfologia più nitida soprattutto intorno ai bordi esterni e il NS è progressivamente più uniformemente diffusa in tutto il volume della sferoide con più giorni nella cultura. Inoltre abbiamo stimato la sfericità della 10 sferoidi in base alla lunghezza del loro assi maggiore e minore. La sfericità medio è 0.92 ± 0,04 per Patu8902 da solo (tumore), 0.95 ± 0,04 per PS1 (stromali) da solo e 0.94 ± 0.02 per sferoidi di co-coltura.

Analisi funzionale metabolica del pancreas sferoidi 3D utilizzando il analizzatore di flusso extracellulare
Per verificare la funzionalità di sferoidi, abbiamo impiegato metabolica e analisi bioenergetica per sondare le vie energetiche in sferoidi. Abbiamo effettuato un test di stress di glicolisi su sferoidi coltivate come descritto sopra. A tal fine, sferoidi generati dalle cellule Patu8902 o PS1 oltre a quelli derivanti da una co-coltura delle due tipi cellulari sono stati sottoposti a test. Interessante, tutti i tre tipi di sferoidi, se che proviene dalle cellule distinte o miste, hanno esibito una risposta biologicamente funzionale per il dosaggio di GST. Al momento di iniettare una saturante concentrazione di glucosio, i tipi di sferoidi testati Visualizza aumenti nella via glicolitica, come evidenziato da un aumento in ECAR (Figura 3). Quando, produzione mitocondriale di ATP è stata inibita utilizzando oligomycin, produzione di energia si sposta verso la glicolisi e spinto le cellule alla massima capacità glicolitica, vista come ulteriore aumento ECAR. Inibizione della glicolisi utilizzando 2-DG, un glucosio analogico che lega competitivamente glucosio esochinasi, ha provocato una diminuzione in ECAR, confermando che il precedente aumento ECAR è stato a causa di attività glicolitica. Abbiamo notato che le sferoidi testati in questo studio ha risposto in questo modo, anche se la PS1 solo sferoidi (diametro medio 250 µm) avevano un segnale relativamente inferiore, probabilmente a causa della loro dimensione più piccola e bassa capacità glicolitica rispetto al cancro Patu8902 cellule (diametro medio 600 µm). In generale, una maggiore ECAR segnale dalla cellula del tumore derivata sferoidi rispetto a quelli da relativamente più piccolo del fibroblasto PS1 derivato sferoidi, potrebbe probabilmente essere attribuita a inclinazione di metabolica intrinseca delle cellule tumorali verso glicolisi^{22, 23}. Tutti i tre tipi di sferoidi sono stati derivati dalla semina lo stesso numero di cellule, anche se abbiamo notato che la variazione della dimensione della sferoide fra ogni tipo, con PS1 solo sferoidi essendo il più piccolo, seguita da sferoidi di co-coltura, e Patu8902 da sola sferoidi essendo il più grande.

Per verificare la funzione mitocondriale in sferoidi 3D, abbiamo sottoposto sferoidi di co-coltura ad un dosaggio di MST. Il MST misura parametri chiave della funzione mitocondriale misurando direttamente OCR delle cellule (Figura 4A e 4B). Un'iniezione seriale con composti (oligomycin, FCCP e un mix di rotenone e antimycin A) serviva a misurare parametri chiave mitocondriali quali, produzione ATP, massima respirazione e la respirazione non mitocondriale. Questi parametri e tassi di respirazione basale sono stati ulteriormente utilizzati per calcolare la perdita di protone e ricambio capacità respiratoria (Figura 4). Una diminuzione in OCR in risposta a oligomycin, un inibitore del trifosfato di adenosina synthase (complesso V) è correlato alla respirazione mitocondriale associata con produzione di ATP cellulare. Sferoidi sono state incubate con oligomycin per una durata più lunga consentire la massima penetrazione e tempo di risposta efficiente. Una seconda iniezione con il disaccoppiante FCCP stimola il massimo consumo di ossigeno e un corrispondente incremento di OCR. L'OCR FCCP-stimolato è stato utilizzato per calcolare ricambio capacità respiratoria, una misura della capacità della cellula di rispondere alla domanda di maggiore energia. La terza iniezione; un mix di rotenone, (un complesso ho inibitore) e antimycin A (un inibitore del complesso III) blocca la respirazione mitocondriale, vista come una forte diminuzione in OCR (Figura 4BONG >).

Nel complesso, le nostre osservazioni confermano la funzionalità di sferoidi coltivate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare come una misura della loro impronta/attività metabolica sia in termini di potenziale glicolitico e mitocondriale come descritto sopra.

Figura 1 . Rappresentazione schematica della metodologia per la cultura e il dosaggio di sferoidi di cancro pancreatico cellule/del fibroblasto. Patu8902 e PS1cells sono state coltivate, tripsinizzate, lavate e contati. Per la semina ogni sferoide, Patu8902 (5.000 cellule/pozzetto) e fibroblasti PS1 (10.000 cellule/pozzetto) erano magnetizzati utilizzando NS e stampato su una piastra di crescita cellulare repellente il giorno 1. Dopo la semina, la piastra di crescita era montata su un disco magnetico sferoide (con un magnete sotto ciascun pozzetto della piastra di crescita 96 ben formato) e permise alla cultura per 2-7 giorni ottenere 3D sferoidi. Sferoidi risultante sono stati lavati e trasferiti al sferoide dosaggio micropiastre per svolgere le analisi metaboliche sullo strumento flusso extracellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Crescita di sferoidi di tumore pancreatico-fibroblasto. (A) un'immagine rappresentativa della sferoide di co-coltura Patu8902-PS1 corrispondente al giorno nella cultura è mostrata in alto a sinistra e le dimensioni di diametro di sferoide (µm) sono quantificata di sotto. Progressivo aumento nel formato della sferoide e diffusione di particelle di NS (puntini scuri) in tutto il suo volume è evidente tra 2 e 7 giorni. Sferoidi erano tenute in coltura per altri 2 giorni dopo questo, che non ha provocato un aumento significativo di diametro sferoide. (B) rappresentante immagini di sferoidi derivati dalle cellule del tumore (Patu8902), le cellule dello stroma (PS1) e cellule co-coltivate (Patu8902 + PS1) è mostrato. Dati (C) sfericità sono raffigurati da 10 sferoidi individuali da ogni gruppo. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Glicolisi Stress Test (GST) con pancreatici sferoidi. (A) schematica rappresentazione di un'analisi della funzione tipica glicolitico con vari parametri di dosaggio raffigurato. (B) un esempio di un test di GST eseguita su sferoidi pancreatiche coltivate utilizzando la metodologia descritta. Rampa di iniezione di glucosio su glicolisi visto come un aumento di ECAR, con ulteriore aumento su aggiunta di oligomycin per spegnere la respirazione mitocondriale. ECAR cade in risposta a 2-DG, un analogo competitivo di glucosio, bloccando la glicolisi. Tutti gli sferoidi sono notati per esibire una risposta funzionale per il dosaggio di GST. (C) un'uscita del dosaggio GST utilizzando il generatore di report del produttore raffigurante i tre parametri principali del dosaggio GST. Barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 4. Mitocondriale Stress Test (MST) con Patu8902-PS1 sferoidi. (A) schematica rappresentazione di un'analisi della funzione mitocondriale tipica con vari parametri di dosaggio è raffigurato. (B) un esempio di una MST su sferoidi tumore pancreatico-fibroblasto è mostrato. Sferoidi 3D (C) co-coltura esibiscono una risposta funzionale per il dosaggio di MST. Come previsto, la funzione mitocondriale misurata come un declino in OCR è stata notata quando sferoidi sono stati sfidati con oligomycin, un inibitore di ATP sintasi. Usando FCCP per accelerare il flusso di elettroni provocato maximal OCR, che immediatamente crollato all'inibizione della respirazione mitocondriale usando un - cocktail di inibitori del complesso mitocondriali. Barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Utilizzo di cancro del pancreas, la 3^rd principale causa di cancro decessi negli Stati Uniti²⁴, come esempio e modello, un metodo rapido e coerenza è stato sviluppato per crescere e analisi 3D sferoidi utilizzando il co-coltura delle cellule di cancro del pancreas e attivato fibroblasti del pancreas. Utilizzando magnetico multimateriali, sferoidi che variano nel formato da 400-600 µm di diametro sono stati ottenuti. Questi sono stati sottoposti a test metabolici per verificare correttamente la funzionalità di sferoidi 3D coltivate. Questo metodo è semplice, coerente e può essere facilmente adattato ad altri tipi di cella.

Mentre questa metodologia accelererà e aggiungere il valore traslazionale delle analisi eseguite con sferoidi 3D, può essere migliorata attraverso lo sviluppo di tecniche che consentono il multiplexing di manipolazione della sferoide e movimentazione. Questo dovrebbe ridurre ulteriormente la complessiva tempo, costo e la manodopera necessaria per svolgere il test. Inoltre, volumi sferoide possono essere utilizzati per normalizzare i segnali di OCR come riportato da altri⁶. Volume della sferoide normalizzati dal volume medio di una cella potrebbe essere utilizzato per determinare OCR per la cellula, ma dal momento che la crescita di sferoidi non saranno identico, calcolando un assoluto OCR per cella potrebbe essere difficile. Attualmente, questa metodologia è limitata dalla mancanza di uno strumento efficace per multiplex sferoide movimentazione e trasferimento da placche di crescita ambiente di test.

Il metodo descritto è modificato e adattato dalla tecnologia magnetica multimateriali e ulteriormente convalidato per mostrare la rilevanza funzionale applicando le sferoidi coltivate a un'analisi metabolica a valle. Il metodo fornisce un importante strumento per generare sferoidi robusti, praticabile e funzionale che contengono i due tipi principali delle cellule trovati nella maggior parte dei tessuti del tumore, le cellule tumorali e fibroblasti di cancro associato, che possono essere impiegati per altri saggi in fase di sperimentazione, ad esempio gli schermi della droga. La relativa facilità e l'efficienza della metodologia NS è un miglioramento importante sopra altri metodi²⁵, come l'impiccagione drop metodo^2,26 di generazione sferoide.

Sferoidi robusti generati come tali forniscono un in vitro del tumore modello che include cellule stromali, che spesso mancano da molti studi di cultura 3D. Le possibilità di applicazione dei modelli 3D sferoide creati come tali sono molto vaste. Ad esempio, tali modelli possono essere impiegati per studiare le interazioni cellula-cellula, turni di bioenergetica e di testare la suscettibilità genetica e dipendenza dei vari regimi terapeutici. Sferoidi 3D che ricapitolano il microambiente tumorale in vivo servono come strumento altamente pertinente e utili per gli studi e quelli indagando i meccanismi di azione di terapeutica corrente e romanzo di screening di stupefacenti. Analisi metaboliche sondaggio vie energetiche utilizzando sferoidi culture con cellule mutanti possono contribuire a gettare nuova luce sul ruolo di questi geni e vie relative nel pathobiology in un modello 3D rilevante di cancro, come sferoidi descritti in questo studio.

La riuscita applicazione di questo metodo si basa innanzitutto sulla salute delle cellule necessarie per la stampa magnetica, motivo per cui cella crescendo in fase logaritmica dovrebbe essere raccolte e magnetizzato. È fondamentale utilizzare l'unità magnetica sferoide per stampare celle magnetizzate e non l'unità di holding, che dovrebbe essere utilizzato solo durante il lavaggio della sferoide e media replenishing passaggi del metodo descritto. L'altro aspetto più critico per il successo della lettura di saggi metabolici è mantenere la morfologia di sferoidi durante il processo di trasferimento dalla piastra di crescita per la piastra di dosaggio.

Nel complesso, questo protocollo è stato stabilito per la generazione di sferoidi 3D che contengono sia cancro e cellule stromali, dopo successivi test metabolici di sferoidi utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Le caratteristiche principali di questo metodo sono che è rapido, facilmente adattabile e coerenti, pertinenti e imita il microambiente tumorale in vivo , è relativamente poco costoso e può servire come un nuovo strumento per studiare la biologia del tumore e lo sviluppo di anticancro agenti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA	Sigma	25300-054
96 well cell repellant plate	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
D-Glucose	Sigma	D9434
DPBS	Gibco	14190-144
Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
L-Glutamine	Sigma	59202C
Mitochondrial Stress Test Kit	Agilent Technologies	103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D Bioscience	655841	Part of Spheroid Bioprinting Kit:  store at 4°C
Patu8902 cells	Laboratory Stock		pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells	Laboratory Stock		activated pancreatic stellate cells
RPMI1640	Gibco	11875-093	growth media for cells, spheroids
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer	Agilent Technologies		extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636
XF Base media	Agilent Technologies	102365-100	base media for metabolic assays on XFe96