기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

Summary

결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.

Abstract

기자 효소 형광 (REF) 효소 이미징 또는 형광 또는 생물 발광에 의해 감지에 대 한 관심의 대상 생물에 존재에 대 한 관련 된 기질을 활용 합니다. 우리는 BlaC, constitutively 모든 M. 결핵 종자로 표현 하는 효소를 이용 한다. REF는 감염 된 쥐의 폐에 있는 박테리아의 급속 한 정량화를 허용 한다. 쥐의 동일한 그룹 많은 시간 포인트, 크게 비용 절감, 보다 신속 하 게 박테리아를 열거, 호스트 병원 체 상호 작용에 비 발한 관측을 허용 하 고 통계적 인 힘을 증가 하는 그룹 당 더 많은 동물을 쉽게 유지 됩니다 때문에 몇 군데 있습니다. . REF는 매우 BlaC 효소 기자의 촉매 특성으로 인해 과민 하 고 특정 사용자 지정 flourescence 공명 에너지 전달 (무서 워) 또는 fluorogenic 기판 사용. REF 필요 하지 않습니다 재조합 종자, 일반 호스트 병원 체 상호 작용을 보장. 800에서 최대한 방출 무서 워 기판 사용 M. 결핵 감염의 영상 설명 nm. 기판의 파장 포유동물에 중요 한 깊은 조직 이미지를 수 있습니다. 우리는 어로 졸 감염 M. 결핵, 쥐의 마 취, REF 기판, 광학 이미징의 관리와 쥐의 개요 것입니다. 이 방법은 호스트 병원 체 상호 작용 및 M. 결핵를 대상으로 하는 항생제의 효능 평가를 성공적으로 적용 되었습니다.

Introduction

M. 결핵 의 느린 성장 속도 결핵^1,2,3의 신속한 진단에 주요 장애물입니다. 문화 기반 진단 소요 주 결과를, 반면 acid-fast 얼룩은 어린이⁵ 와 인간 면역 결핍 바이러스^6,7공동 감염 환자에서 진단 제한⁴ . 광학 이미징 기술은 최근 결핵^8,9를 위한 전통적인 진단 방법의 대 안으로 인정 되었습니다. 형광 및 생물 발광 광학 실시간^{10,11,12,,1314, 살아있는 동물에 M. 결핵 의 이미지를 사용할 수 있습니다. 15,,1617,,1819}. 광학 이미징 M. 결핵^20,,2122감염의 신속 하 고 구체적인 평가의 이점이 있습니다.

우리는 REF를 사용 하 여 라이브 쥐에 M. 결핵 의 광학 이미징에 대 한 세부 정보를 설명 합니다. 이 방법은 매우 구체적이 고 민감한^23,24 이며, 다른 광학 방법에 유사한 적은 결핵 (TB) 이미징²⁵, 단층 촬영 (CT)²⁶, 자석 등의 다른 방법 보다 비싼 공명 영상 (MRI)²⁷, 그리고 F-fluorodeoxyglucose 양전자 방출 단층 촬영/CT (F FDG PET/CT)²⁸. REF 세균성 효소에 의해 쪼개 짐에 따라 형광 제품^8,29를 생산 하는 사용자 지정 형광 또는 발광 기질을 활용 합니다. 따라서, 재조합 mycobacterial 기자 스트레인^30,31를 요구 하지 않기의 이점이 있다. 설명 무서 워 기판은는 형광 색소와 끄는 BlaC (β-lactamase), 자연스럽 게 결핵-복잡 한 진 균^8, constitutively 표현에 의해 분해 되는 β 락탐 반지에 의해 연결 된로 구성 ³². 박테리아는 직접 많은 크기 순서와 M. 결핵의 민감한 감지에 의해 증폭 수 REF 촉매 활동으로 인해 신호를 생성.

이 연구에 사용 된 REF 기판 생체에 우수한 조직 침투 있으며 감소의 긴 파장 때문에 배경. 이 긴 파장 기판으로 그것은 거의 100의 M. 결핵 에 대 한 탐지의 문 턱을 달성 하는 것 콜로 니 형성 단위 (CFU) 생체 외에서 그리고 < 쥐 vivo에서 (전체 동물)^{8, 폐에서 1000 CFU 33}. REF가 래, 임상 자료와 환자 마이크로 내 시경 시스템^16,32,,3334 그것의 높은 감도 및 특이성 때문에 직접 진단 도구로 사용할 수 있습니다. REF는 BlaC, 자연스럽 게 생산된 세균 효소를 사용 하 여 검색 모든 긴장에 때문에 어떤 결핵 임상 스트레인에 적용할 수 있습니다. 이러한 특성 pathogenesis의 분석 뿐만 아니라 REF 일반적 치료 촉진 하기 전 임상 결핵 연구에 유용한 도구를 이미징 및 백신 평가 하지만 또한 궁극적으로 결핵 진단에 적용할 수 있습니다. 환자입니다.

Protocol

동물 연구 지침 및 규정에 명시 된 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 텍사스 A & M 대학에 의해 수행 되었다. 검토 및 생물 안전 요원 또는 위원회에서 승인이 필요할 수 있습니다.

주의: 모든 절차 BSL3 포함을 해야합니다. 직원은 항상 개인 보호 장비를 착용 해야 합니다. 모든 조작은 Biosafety 내각 (BSC) 안에 수행 되 고 모든 sharps sharps 용기에 삭제 됩니다. 작업을 시작 하기 전에, 작업 후 작업 표면 및 BSC 버퍼링 된 페 놀 및 70% 에탄올으로 청소 됩니다. 절차는 일반적으로 결핵균, biosafety 수준 3에서 할 것 이라고 하지만 일러스트 레이 션 및 촬영 목적에 대 한 저자 덜 악성 박테리아와 biosafety 수준 2에서이 절차를 보여.

1. 긴장 조건 문화

참고: M. 결핵 변형 CDC1551는이 연구에 사용 되지만 어떤 M. 결핵 긴장 든 지 같은 방식으로 사용할 수 있습니다.

1. M-OADC-TW에 박테리아를 성장 (7 H 9 국물 0.5% 글리세롤, catalase, 없이 복잡 한 10% 올레산 포도 당 0.05와 보충 트윈-80%) 0.5 세₆₀₀ 를 37 ° C에 중간 서 (~ 0.2 x 10⁷ CFU).
2. M-OADC-TW에 문화를 희석 (1시 10분의 시리즈는 박테리아의 희석). 접시는 박테리아의 희석 (10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸) CFU의 수 있도록 선택적 7 H 11 접시에 3 중에.
3. 37 ° C에 또는 식민지 정확 하 게 계산 될 수 있는 때까지 4 주에 대 한 번호판을 품 어.
4. 8,534 x g는 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안에 세균성 inoculum 원심 한 번 식 염 수 10 mL와 펠 릿을 세척 (0.9 %NaCl) 염 분의 15 mL에 펠 릿을 다시 중단 (0.9 %NaCl).

2.에 어로 졸 감염 매디슨 챔버를 사용 하 여 마우스의

1. 1 주일에 대 한 새로운 환경에 적응 하는 쥐를 수 있습니다.
2. 챔버에 그들을 로드 하기 전에 마우스 무게.
3. 3 코드 전원 스트립에 연결: 메인 챔버 전원, 진공 펌프와 공기 압축기를 순서 대로.
4. 유리 용기는 조심 스럽게 나사. 유리 항아리 biosafety 내각에 고 염 분의 15 mL에 도전 inoculum을 추가 (0.9 %NaCl) 달성 하기 ~ 10⁴ -10⁶ CFU 폐에 박테리아의.
5. Biosafety 내각에서 유리 항아리의 뚜껑을 닫습니다. 분무기 단위에 항아리를 연결 하 고 (입구) 하단은 항아리에서 액체의 수준 아래 인치의 4 분의 1에 대 한 수직 스테인리스 튜브를 조정.
6. 챔버로 (챔버는 최대 90 마우스를 수용할 수) 실험에 필요한 모든 동물을 로드 하 고 문을 모든 래치를 닫습니다.
7. 메인 (룸) 확인 공기 흐름 미터. (공) 부동의 센터 약 50 L/분으로 왼쪽에 규모 측정 실행 확인 하십시오.
8. 챔버의 제어판에서 시작 단추를 누릅니다. 규모에 4 L/min으로 압축기 공기 흐름 미터 (왼쪽에 작은 미터)를 통해 공기 흐름 속도 설정 합니다. 시각적으로 도전 inoculum는 되 고 nebulized 되도록 확인 합니다.
9. 15 분 후 제어판의 앞에 빨간 불이 나타나고 음성 신호는 실행의 끝을 나타냅니다 때 타이머를 다시 설정 하려면 제어판의 오른쪽 아래 모서리에 리셋 버튼을 누릅니다.
10. 출시 진공 챔버의 문에 작은 빨간 버튼을 누른.
11. 약 실 문 열고 동물을 제거 합니다. 다시 그들의 감 금 소에는 마우스를 놓습니다.
12. 유리 분무기 단지를 제거 하 고, 누설 방지 운송 컨테이너에 배치. 생물 안전 캐비닛 내부의 컨테이너를 놓고 지정된 폐기물 컨테이너에 도전 정지를 삭제.
13. 생물 학적 가방 안에 사용된 분무기 단지를 놓고는 압력솥에 수송을 위한 부 대를 밀봉 합니다.
14. 감염 프로시저의 끝에, 버퍼링 된 페 놀 및 70% 에탄올과 챔버의 내부를 스프레이 하 고 10 분 동안 앉아 챔버를 허용 합니다.
15. 그런 다음 모든 액세스할 수 있는 내부 표면 아래로 매우 철저 하 게 닦아. 모든 오염 된 종이 타 올, 등의 처분. 생물 학적 쓰레기. 압력솥에서 쓰레기 컨테이너를 낭비 하 고 분무기 항아리를 사용.
16. 영상 시간 포인트까지 제약 실에서 다시 동물을 놓습니다.
17. 이미징의 날, 이미징 방에 보조 용기에 동물을 전송 합니다.

3. 동물 마 취

1. 쥐와 isoflurane 사용자 정의 가스 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize.
2. 각 마 취 단위 위에 있는 두 개의 숯 필터 용기 무게.
3. 무게는 초기 무게 위에 50 g 경우 새로운 용기를 바꿉니다.
4. 절차에 대 한 충분 한 isoflurane 되도록 기화 장치를 확인 하십시오.
5. 챔버 내부에 이미징 코 콘 홀더를 배치 합니다. 코 콘 절차에 필요한 수 놓고 코 콘 차단제와 나머지 오프닝을 밀봉 합니다.
6. 고압 실린더에서 산소 공급을 켭니다 고 55 psi에 그것을 설정 합니다.
7. 마 취 단위 있는 피난 펌프를 켜고 8 L/min으로 설정.
8. 마 취 단위 있는 산소 토글 설정.
9. 마 취 유도 실 1.5 L/분 차례에 가스의 흐름 가스 흐름을 설정 하에 가스 흐름을 켭니다.
10. 가스 흐름 0.25 L/분 차례에 가스의 흐름 가스 흐름을 설정 하려면 이미징 챔버를 켭니다.
11. 켜고 isoflurane 기화 기 2-2.5%에 설정 합니다. 수와 isoflurane 기화 (~ 20 g의 무게는 마우스에 대 한 2-2.5%, 무게 300 g 기니 피그에 대 한 4%)에 다이얼을 회전 하 여 실험을 위해 사용 되는 동물의 무게에 따라 isoflurane 수준을 조정 합니다.
12. 마 취 약 실에 쥐를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 마 취 유도 약 실에 가스 흐름을 켭니다.
13. 5-10 분까지 완전히 마 취 마 취 유도 실에서 쥐를 둡니다.
14. 일단 쥐 취는 이미징 동안 그들을 보호 하기 위해 눈에 광 연 고를 적용.
15. 그들의 코는 이미징 절차 동안 쥐의 마 취를 촉진 하기 위하여 원뿔에 배치 되도록 복 부 또는 sternal recumbency에 쥐를 놓습니다.

4. 기자 효소 형광 (REF) 이미징

1. 주사는 감염으로 복 주입 제어 마우스에 의해 기판 (20 µ M, 무게의 2.5 µ L/g). 쥐 1 분 미만 대 한 이미징 챔버 내부 마 취 받고 있다.
2. 이미징 시스템을 시작 합니다.
3. 초기화를 클릭 하 여 시스템을 초기화 합니다. 온도 바 녹색으로 바뀝니다 때까지 기다립니다.
   참고: 이미징 챔버 이미징 동안 동물의 체온을 유지 하기 위해 온수 플랫폼으로 구성 됩니다.
4. 영상 수집 설정, 형광을 선택 | 전체 동물에 대 한 트랜스-조명 또는 폐 조직에 대 한 피 조명 수집 컨트롤 패널에서 오버레이 및 구조.
5. 단일 마우스 및 램프 수준 높은 b 보기의 필드를 설정 합니다.
6. 780에서 자동, 중간 binning, 2-3 f/정지, 그리고 여기 745 nm 및 방출 필터에 필터에 대 한 노출 시간을 설정 840 nm nm.
7. 시퀀스 설정에 대 한 시퀀스 설정 클릭, 폐 지역에서 9-12 트랜스 조명 포인트를 선택 합니다.
8. 이미지 수집에 대 한 취득을 클릭 합니다.
9. 케이지 후 이미징에 다시 마우스를 놓습니다.
10. 완전히 복구 될 때까지 마우스를 모니터링 하거나 실험의 시간 포인트에서 이미징 하는 경우 CFU 측정을 위해 희생. 수정된 Karnofsky 점수 후 이미징 쥐의 모니터링을 수행 합니다.

5입니다. REF 이미징 분석

1. 이미징 소프트웨어를 엽니다.
2. 찾아보기 아이콘을 클릭 하 여 이미지 파일을 로드 합니다.
3. 스펙트럼 unmixing 스펙트럼 Unmixing 도구 팔레트에서 클릭을 unmix 하는 데 필요한 스펙트럼을 클릭 합니다. 시작 unmixing 클릭 하십시오.
4. 광학 표면 재건에 대 한 표면 지형 클릭.
5. 에 등, 모피 마우스 따라를 선택 하 고, 표면 생성을 클릭 합니다.
6. 이미지 자르기 그리고 관심 영역에 대 한 임계값 이미지를 설정 합니다. 완료를 클릭 합니다.
7. 장기 등록에 대 한 3 차원 광학 도구 드롭다운 메뉴에서 등록 탭으로 이동 합니다.
8. 등록 기관 아틀라스의 장기.
9. 기관 크기 또는 패널 등록 도구에 있는 온/오프 변환 도구를 사용 하 여 생성 된 표면 지형에 위치를 조정 합니다.
10. 형광 단층 (휙) 3D 재구성, 이동한 선택 분석 탭 선택 이미지 분석에 대 한 포함 될, 이미지 전송 형광 정규화 (NTF) 효율성을 종류, 시작을 클릭 합니다.
11. 모든 선택에 확인 하 고 데이터 미리 보기 탭에서 재구성.
12. 형광 정량화에 대 한 관심의 기관에 투자 수익 큐브 관심 영역 (ROI) 도구를 추가 하 고 관심의 장기를 큐브 크기 조정 이동 합니다. 클릭 3D ROIs를 측정.
13. 투자 수익 측정 창에서 3D ROI 측정 이동, pmolM^-1c m^-1을 소스 복 및 측정 단위를 데이터 형식을 선택 합니다.
14. 저장 하거나 날아다니는 3D 재구성 분석 결과 그림 또는 데이터 파일로 내보내기.

6입니다. CFU로 박테리아의 정량화

1. 0.1 mL pentobarbital 나트륨 (390 mg/mL)의 복 주입 하 여 쥐를 안락사.
2. 반사 반응이 있는지 확인 하는 쥐의 발 패드를 압박 하 여 페달 반사를 확인 합니다.
3. 소독 집게와가 위를 사용 하 여 마우스에서 폐 조직 explant 폐 조직 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1 mL에 균질
4. 살 균 1 x PBS에서 폐 homogenate의 10 연속 희석을 확인 합니다.
5. 도금, 대 한 천 배지에서 20 µ L 각의 각각 희석의 3 aliquots 자리.
6. 세균성 성장 위한 37 ° C와 모니터 인큐베이터에 접시를 품 어.
7. 수 각 식민지 보육 시간 후 고 CFU로 표현 / mL 및 희석에 대 한 수정 하 여 다음 식을 사용 하 여:
   CFU / mL (C/V) = M x
   어디 C 자리, V 당 식민지 카운트 = = 볼륨 샘플 각 접시 (mL), 및 M 주사 = 곱셈 요인 (희석 사용의 역).
   참고: 경우 11 식민지 10^-4의 샘플 희석에 0.002 mL의 샘플 볼륨에 대 한 한 자리에서 세 어진다, 방정식를 사용 하 여 식민지 수 산출 될 것 이다로
   (11/0.02) x 10⁴ = 5.5 x 10⁶ CFU / mL

Discussion

REF, 같은 이미징 기술을 사용 하 여 강력 하 고 일관 된 데이터의 생성을 허용 하는 주요 전략 있습니다. 광학 이미징 이후 모든 방향으로 방출 하는 빛을 포착 하기 어려운, 침투의 깊이 영향을 줄 수 있는 조직에 흩어져 빛을 생성 합니다. 사용 근처 적외선 fluorophore (NIR)의 REF 700-900 nm의 Querange에 여기 및 방출 하는 파장을 갖는 이미징에 대 한 기판 포유류 조직에 의해 형광 신호의 최소한의 흡수를 용이 하 게 한다. 사용자 정의 설계 기판 NIR fluorophore, IRDye 800Cw를 끄는에 연결 하 여 건설 되었다 IRDye QC-1, 형광 공명 에너지 전송 기반 냉각 허용 락탐 반지에 의해. IRDye 우수한 조직 침투는 빛 산란 특성 및 포유류³⁶에 분명 어떤 유해한 효과 없습니다, 24 h 형광 혈액과 기관에서 허가 되 고 신호 크게 증가 시작 후 4 h 기판 관리, 관리 후 6 h 레벨 최대에 도달.

세균 감염 복용량, 감염 복용량과 기판의 관리 시간 게시물 감염 파일럿 연구를 수행 하 여 이미징의 포인트의 모드는 크고, 복잡 한, 실험에 착수 하기 전에 표준화 되어야 한다. 파일럿 연구 크게 줄일 수 시간 및 비용 표준 절차 주요 실험 하 고 이전에 최적화 될 수 있기 때문에 동물의 많은 수를 이미징 하는 경우. 세균 중 관심 몸 전체 이미징 트랜스 조명과 epi 조명 신호 소스를 확인 하 고 상관 관계의 품질을 결정을 사용 하 여 폐 이미징 비보 전 을 사용 하 여 다음의 기관/조직에 결정 되어야 한다 박테리아와 함께 현재⁸번호. 파일럿 연구는 탐지의 문 턱, 기술의 동적 범위 이미징에 대 한 최적의 실험 조건의 결정에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.

그것의 높은 감도 자연 M. 결핵 을 이미지 하는 능력으로 이미징 REF를 사용 하 여의 주요 장점은 다른 형광 및 발광 전략에 비해 긴장. REF 이미징 모든 M. 결핵 임상 격리 및 결핵-복잡 한 긴장에 보존 BlaC 촉매로 강력한 효소를 사용 합니다. REF 이미징의 큰 감도 촉매 그만큼 BlaC의 조합에 주인 세포에 의해 쪼개진된 형광 제품의 유지와 함께 예정 이다. 신호 지속적으로 증가 기판은 결과 감염 된 세포와 조직 내에서 신호의 거의 무한 한 빌드에 사용할 수 있습니다. 이미징 REF의이 증가 된 감도 이미징의 다른 방법에 비해 두 시험관에 M. 결핵 의 특정 검색 허용 한다 vivo에서^{8,,2324, 29}.

REF 이미징 세균 검출 감염 모델, 어느 실험실 동물^8,37 또는 인간의 임상 자료^29,38 의 직접 응용 프로그램을 사용 하는 유전 수정 없이 사용할 수 있습니다. . REF는 fluorogenic 기판 kinases, 프로 테아 제, β-galactosidases, ureases, 등 BlaC 이외의 수많은 효소 목표를 위해 개발 될 수 있기 때문에 다양 한 병원 체^39,40, 이미지를 감지 하 사용할 수 있습니다. 그러나, 주의 생각 있도록 대상에 주어져야 한다 그것은 이미징에 대 한 최적의 특성 표시 합니다. BlaC이이 전략의 성공적인 응용 프로그램을 보장 하는 특성에 대 한 좋은 모델 효소를 나타냅니다. REF 이미징 제공 즉시 읽어 폐에 존재 하는 세균 중에 감염, 시의 결핵 병, 세균성 수의 결심은 일반적으로 3 ~ 6 주, 필요로 하기 때문에 하지만 더에 크게 진행 속도 이 이렇게 훌륭한 제의로 저장할 것 이다 급속 한 성장 하는 생물 시간. REF는 carcinomas 결핵, 결 절 성 병 변 환자^41,42의 진단에 중요 한 문제에서에서 차별 또한 사용 수 있습니다. REF 가속 변환 결핵 영상 소설 도구 역할 하 고 심지어 잠재적으로 치료 결과의 빠른 예측을 허용 하는 인 간에 게 적용할 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	VETONE	501027
CNIR800	Custom synthesized
Fatal Plus solution	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth	BD	271310
OADC Middlebrook enrichment	BD	212351
Sporcidin		RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar	BD	212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262
XGI-8-gas Anesthesia System	Perkin Elmer
Living Imaging software	Perkin Elmer
Transparent nose cones	Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551	ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks	Jackson Laboratory