Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Resumo

O objetivo do presente protocolo é demonstrar a injeção intrabenigna de células de câncer de próstata, com posterior castração. Ortotópico modelos pré-clínicos de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração são críticos para estudar a doença no contexto de um microambiente do tumor clinicamente relevantes e um host imunocompetentes.

Resumo

Modelagem de tumor ortotópico é uma ferramenta valiosa para pesquisa do câncer de próstata pré-clínicos, como tem várias vantagens sobre os dois subcutânea e geneticamente modificado geneticamente modelos do rato. Ao contrário dos tumores subcutâneos, ortotópico tumores contêm vasculatura clinicamente mais precisa, microambiente do tumor e respostas a várias terapias. Em contraste aos modelos do rato geneticamente modificados, ortotópico modelos podem ser realizados com menor custo e em menos tempo, envolvem o uso de mouse altamente complexo e heterogêneo ou linhas de células cancerosas humanas, prefiro que única alterações genéticas e estas células linhas podem ser geneticamente modificados, tais como express agentes de imagem. Aqui, apresentamos um protocolo para cirurgicamente, injetando uma linhagem de células de câncer de próstata murino luciferase - e mCherry-expressando no lobo anterior da próstata de ratos. Estes ratos desenvolveram ortotópico tumores que foram monitorados não invasiva na vivo e ainda mais analisaram para tumor volume, peso, sobrevivência de rato e infiltração imune. Além disso, ortotópico tumor-rolamento ratos foram castrados cirurgicamente, levando a regressão do tumor imediata e subsequente recorrência, representando o câncer de próstata resistente a castração. Embora a habilidade técnica é necessária para efectuar este procedimento, este modelo ortotópico syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração é de grande utilidade para todos os investigadores no campo.

Introdução

Câncer de próstata é estimado para ter a maior incidência (161.360 homens) e causar a morte de terceiro-a maioria de câncer masculino (84.590 homens) em 2017¹. Após o diagnóstico, tumores da próstata são andrógeno-dependentes e são tratados pela prostatectomia cirúrgica, radioterapia e/ou terapia de privação do andrógeno (ADT), no entanto cada tratamento está associado a vários principais morbidades e complicações^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. regressão de tumor após ADT, apesar de quase todos os tumores reincidência como câncer de próstata resistente a castração (CRPC). Nesta fase, aprovadas terapias incluem docetaxel, imunoterapia Sipuleucel-T e a enzalutamide de pequenas moléculas anti-andrógeno abiraterone, ainda não há terapia individual confere uma vantagem de sobrevivência de mais de 5,2 meses^{11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}. portanto, os homens em todos os estágios do câncer de próstata precisam tanto as opções de tratamento melhorado e gestão das morbidades, qual doença pré-clínica ideal de modelagem é crucial.

Com o procedimento correto, linhas de células de câncer de próstata podem ser cirurgicamente instiladas na próstata murino, levando ao desenvolvimento de ambos os tumores syngeneic ou xenogénica ortotópico. Modelagem de tumor ortotópico é ideal para todos os tumor biologia e drogas desenvolvimento pesquisa, permitindo desenvolvimento de tumor com um microambiente do tumor clinicamente representativa (TME). Estudos prévios demonstraram que tumores subcutâneos de (s.c.) tem uma vascularização do tumor alterado, levando a diferenciais e menos respostas clinicamente precisas para antiangiogênico terapias^18,19. Além disso, vários estudos têm observado aumentada ou diminuição da eficácia de vários chemotherapeutics no tratamento da mesma linha de célula, dependendo se foi administrada s.c. ou orthotopically, o último dos quais melhor representado o que é visto em humanos câncer de^21,20,22. Além disso, apenas em um modelo ortotópico de câncer de cólon, mas não no modelo s.c., tumores produzem as enzimas degradativos corretas necessárias para induzir a metástase²³. Finalmente, como imunoterapias continuam a surgir na vanguarda da terapia do câncer, e especialmente como eles ainda têm que fornecer um benefício significativo para o câncer de próstata^24,25, syngeneic modelos pré-clínicos com TME preciso e drenagem dos gânglios linfáticos em hospedeiros imunocompetentes são críticos.

Há muitos fatores responsáveis por estes resultados inconsistentes com base no local do tumor. Com uma altura diferente, as células cancerosas estão expostas a diferente endotélio tecido-específica e alteraram a angiogênese, afectando assim o tumor desenvolvimento^26,27. Ortotópico tumores com o correto TME permitem a entrega da droga clinicamente relevantes, condições de hipóxicos e avaliação de antiangiogênico terapias²⁸. Enquanto modelos geneticamente modificados (gemas) contêm um TME preciso, requerem tempo tempos para reprodução, custo elevado e são muitas vezes baseiam em manipulações de único ou poucos genes nocauteado ou overexpressed além níveis clinicamente relevantes. Em contraste, as linhas de células de câncer de próstata humano ou murino usadas em tumores ortotópico, como tumores humanos, são geneticamente muito mais complexas dentro de células individuais e na heterogeneidade entre células^29,30de exibição. Também ao contrário de pedras preciosas, ortotópico linhas de células de câncer podem ser projetadas para expressar as modalidades de imagem ou aumento ou diminuição dos níveis de outras moléculas de interesse e in vitro e in vivo de resultados experimentais pode ser directamente comparado. Ortotópico tumores também podem ser formados de células derivadas de paciente primárias. Aqui, nós relatamos a metodologia para a realização de injeções intrabenigna de células de câncer de próstata que formam tumores de ortotópico andrógeno-dependentes e, após a castração, se repetirá como ortotópico CRPC.

Protocolo

Todos os animais procedimentos descritos no presente protocolo devem ser executadas em conformidade com as normas éticas e a aprovação da Universidade apropriada cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC).

1. preparação de materiais cirúrgicos e células de câncer

1. Antes do dia da cirurgia, autoclave a tesoura microdissecando, pinça Graefe, fórceps do tecido Graefe, porta-agulha com cortadores de sutura e o número apropriado de cortinas. Esterilize agulhas de calibre 28 e uma seringa de 50 µ l de gás de óxido de etileno (Figura 1).
2. Antes do dia da cirurgia, células de cultura Myc-CaP em pratos de 10 cm em RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S) numa incubadora 37 ° C 5% CO₂ . Para o monitoramento de tumor bioluminescente e/ou fluorescente, transfect 293T células com os vetores apropriados e posteriormente transduce células Myc-CaP com 0,45 µm filtrada lentivirus³¹. Classificar as células para gerar uma linha celular estável com 100% de positividade de transdução.
   Nota: Executar toda cultura de tecido em condições estéreis e verifique se todas as linhas de célula livre de micoplasma. A linha de celular de câncer de próstata murino utilizada neste estudo, Myc-CaP³², é transfectada para expressar estàvel tanto luciferase de vaga-lume e mCherry. A Myc-CaP célula linha iss isolada de um c-myc-superexpressão Hi-myc mouse e essas células contêm um receptor de andrógeno amplificado (AR), que são andrógeno-dependentes³² e formar tumores CRPC após castração murino³³. Todos os mouses neste estudo são camundongos FVB/NJ machos de 6 e 8 semanas de idade. Linhas de células de câncer de próstata murino alternativo podem ser usadas com os ratos de fundo genético adequado, bem como linhas de células de câncer de próstata humano ou células de câncer de próstata derivado de paciente primário com camundongos imunodeficientes. O número ideal de células por injecção deve ser determinado empiricamente para linha celular alternativo. Além disso, a alternativa modalidades de imagem pode ser utilizada para visualizar tumores, incluindo tomografia por emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) ou tomografia computadorizada (CT), bem como as boas práticas agrícolas como alternativa à mCherry.
3. A noite anterior à cirurgia, coloque matrigel matriz de membrana basal e vermelho de fenol-livre no gelo a 4 ° C para descongelar.
4. No dia da cirurgia, recolha as células de lavá-las com solução salina tamponada fosfato (PBS) e desanexando com 0,25% do trypsin-EDTA. Neutralizar a tripsina com RPMI com 10% FBS e 1% P/S.
5. Centrifugar as células a 400 x g por 5 min.
6. Lavar as células com 10 mL de RPMI sem FBS ou P/S.
7. Contar as células e ressuspender as células em PBS em uma concentração de 6.67x10⁷ células/mL (1 × 10⁶ 15 células / µ l).
8. Adicionar um volume igual de matrigel para criar uma suspensão de células de PBS/matrigel 1:1 em uma concentração final de 1 × 10⁶ células/30 µ l e manter as células no gelo até injeção para evitar a solidificação.
   Nota: Efectuar injecções intraprostática dentro de 3 h de preparar matrigel suspensões celulares. Se executar a injeções intraprostática em mais de 5 ratos, repita os passos acima para preparar uma suspensão de células frescas matrigel.

2. preparação do rato pré-operatório

Nota: casa ratos na Universidade animal instalação para pelo menos uma semana antes da cirurgia para permitir a adaptação adequada e minimizar o estresse animal. Etapas 2.1-2.6 são executadas pelo assistente do cirurgião. Todas as etapas cirúrgicas subsequentes são realizadas pelo cirurgião usando luvas estéreis e instrumentos cirúrgicos com técnica estéril.

1. Anestesia os ratos com isoflurano (2-5% para indução através de câmara, 1-3% para manutenção através do cone de nariz). Verifique se a indução completa pela perda do reflexo de pitada de dedo do pé.
2. Pesar os ratos e administrar pelo menos 0,05 mg/kg da buprenorfina analgésico s.c.
   Nota: O Mouse peso ≥ 20 g é ideal para injeções intraprostática bem sucedidas.
3. Aplica lubrificação pomada oftálmica de ambos os olhos para evitar a secura da córnea.
4. Raspe todos os pelos do abdome.
5. Esterilize o abdômen por três rodadas de aplicação circular do esfoliante cirúrgico utilizando as pastilhas não-aderindo estéril seguidas de toalhetes com álcool estéril. Permitir que o abdômen secar.
   Nota: Para o resto do procedimento cirúrgico, apenas luvas estéreis e instrumentos cirúrgicos podem contactar o abdômen do mouse esterilizado.
6. Transferi o mouse em decúbito dorsal sobre uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento diretamente no âmbito do objectivo de um microscópio cirúrgico limpo.
7. Cubra o mouse com um pano estéril com um pequeno buraco ao longo do abdômen.

3. Intraprostática injeção

Nota: Execute todas as etapas cirúrgicas sob condições estéreis. Ajustando o microscópio, o posicionamento do mouse ou qualquer outros objetos não esterilizados devem ser feitos pelo assistente do cirurgião.

1. Executar um aproximadamente 1cm incisão da pele exterior ao longo da linha mediana do abdômen superior para o pênis e glândulas prepuciais (Figura 1).
2. Separe o tecido conjuntivo entre o exterior da pele abdominal e a musculatura abdominal interna, abrindo a tesoura entre as camadas.
3. Realize uma incisão semelhante da musculatura abdominal interna durante o uso de fórceps para levantar a musculatura para evitar perfurar os intestinos ou bexiga (Figura 1).
4. Localize uma das vesículas seminais bilaterais (figura 1A, branco) / anterior da próstata lóbulos (figura 1A, preto), que são, muitas vezes, posterior, lateral e ligeiramente superior da bexiga (figura 1A, amarelo), mas isto podem variar entre ratos . Os lóbulos anteriores da próstata são translúcidas e anexado para a curvatura menor do brancas vesículas seminais.
5. Levante suavemente a ponta da vesícula seminal, usando a pinça de tecido Graefe para criar tensão no tecido, sem perfurar a vesícula seminal (Figura 1E).
6. Misturar a solução de matrigel Myc-CaP pipetando gentile (interpretada por assistente do cirurgião), como células podem ter peletizado e Aspire lentamente 30 µ l (1 x 10⁶ células) para a agulha para evitar bolhas de ar.
7. Insira cuidadosamente o chanfro do paralelo ao eixo longo do lobo anterior da próstata de agulha. Injecte lentamente 30 µ l para o lobo e retraia lentamente a agulha para evitar vazamento (Figura 1F). Verificar injeção adequada por ingurgitamento do lobo anterior da próstata (Figura 1).
8. Segure cuidadosamente a vesícula seminal e lobo da próstata injetado fora o mouse para aproximadamente 30 s para permitir matrigel parcialmente solidificar dentro do lóbulo. Durante este tempo, recolha algum vazamento de solução de célula no abdômen usando um aplicador de ponta de poliéster estéril para prevenir o desenvolvimento de tumor não-ortotópico, sem pressionar no injetado lobo da próstata.
9. Retorne cuidadosamente a vesícula seminal e o lobo da próstata injetado no abdómen sem exercer pressão sobre o lobo. Substitua quaisquer tecidos exteriorizados.
10. Realize suturas contínuas para fechar a musculatura abdominal interna com as suturas do agulha corte reverso absorvível vicryl 5-0.
11. Realize suturas interrompidas para fechar a pele abdominal exterior com suturas de agulha 4-0 nylon monofilamento não absorvível corte reverso.
    Nota: Staples 9mm esterilizados também podem ser usados para fechar o exterior da pele abdominal. No entanto, em contraste com suturas, eles interferem com qualquer tumor bioluminescente e fluorescente subsequente, sinal de imagem.
12. Limpe todas as ferramentas com álcool etílico estéril toalhitas (inauguradas pelo assistente do cirurgião) e colocá-los em um esterilizador de grânulo de vidro para permitir s. 30 as ferramentas para secar antes de usar o mouse próximo.
13. Lave a seringa e agulha em soro fisiológico estéril (inaugurado pelo assistente do cirurgião) para evitar o entupimento por matrigel remanescente.
    Nota: Um assistente do cirurgião deve estar presente para todas as operações, realizar preparação de rato pré-operatória não-estéreis e cuidados pós-operatórios do mouse, bem como como para misturar a solução de matrigel Myc-CaP antes de injeções. Para minimizar o tempo, como cada procedimento de rato intraprostática exigirá 20-30 min, o assistente do cirurgião pode começar a preparar o próximo mouse como o cirurgião é suturar o mouse atual.

4. pós-operatório Mouse cuidados

1. Administrar 1 mg/kg do meloxicam analgésico s.c. imediatamente, 24 h e 48 h após a cirurgia.
2. Permitir que os ratos se recuperar em uma gaiola com nenhum fundamento colocado na metade do caminho em uma almofada de aquecimento. Monitorar os ratos pelo menos 30 min após a cirurgia até que recupere mobilidade normal e atividade, depois que colocá-los em uma gaiola limpa com comida no chão da gaiola.
3. Mais monitorar camundongos diariamente para cicatrização adequada, peso corporal, aliciamento e deambulação após a cirurgia. Ratos separados em gaiolas individuais em quaisquer provas de luta.
4. Remova qualquer suturas restantes dentro de 14 dias após a cirurgia.

5. bioluminescentes Tumor Imaging

1. Prepare-se estéril filtrada nd⁺ ou K⁺ D-luciferina, como descrito pelo fabricante e protegido da luz.
2. Injete camundongos intra peritoneally com 10 µ l/g de peso corporal de luciferina.
3. Pelo menos 10 min depois, ratos de imagem com um IVIS Spectrum Imaging System, como descrito anteriormente^34,35.
4. Analise imagens usando o Software de imagem vivendo, como descrito anteriormente^34,35.
   Nota: IVIS análise de imagem é útil para determinar o sucesso injeções intraprostática e desenvolvimento do tumor inicial para normalizar a carga de tumor entre grupos experimentais. No entanto, dependendo da intensidade do sinal fluorescente ou bioluminescente, saturação pode causar um platô na quantificação imagem apesar de um aumento no tamanho do tumor real. Portanto, nas fases posteriores de crescimento do tumor, IVIS imagem pode ser mais útil para determinar a diminuição do tamanho do tumor ao tratamento bem sucedido, em vez de aumentos no tamanho após a saturação da imagem.

6. tumor coleção, análise do Tumor, sobrevivência Endpoint

1. Se coletar tumor para análise, humanamente eutanásia em ratos por exposição de CO₂ e deslocamento cervical secundário, ou por métodos alternativos de IACUC aprovado e dissecar os tumores do abdome. Tumores devem ser orthotopically localizado na próstata.
   Nota: Tumores ligado à parede abdominal anterior ou semeado ao longo do abdômen indicam pobre ou com vazamento de injeção intraprostática e não devem ser considerados tumores ortotópico.
2. Pese os tumores.
3. Calcular o volume do tumor como π/6 × L × W × H (L = comprimento do eixo maior do tumor, W = largura perpendicular, H = altura perpendicular).
4. Tumores podem ser analisados pela histologia (correção em formol tamponado a 10% neutro), citometria de fluxo (criar suspensões celulares único), proteína (preparar o tecido lisado no buffer RIPA), ou RNA (imediatamente lugar tecido em RNAlater).
5. Para a análise imunológica, também colete os próstata tumor-drenagem pará-aórtica linfonodos (figura 1B, laranja) e o baço.
   Nota: Se você seguir os ratos para a sobrevivência, o ponto de extremidade deste modelo é definido como o aparecimento de ascite abdominal hemorrágica³⁶ e/ou diminuiu a deambulação, higiene, e/ou Piloereção³⁷. Ratos para análise de sobrevivência recebem analgesia pré e pós-operatória (etapas protocolo 2.2, 4.1) e devem ser monitorados regularmente. Os ratos devem ser separados em gaiolas individuais se qualquer combate ocorre e deve ser humanamente euthanized sobre a aparência de qualquer um das leituras acima de ponto de extremidade.

7. castração para modelar CRPC

1. Para modelar o CRPC, executar acima protocolo injeção intraprostática (protocolo as etapas 1 a 5).
2. Pelo menos uma semana mais tarde, após o desenvolvimento do tumor, realizar castração cirúrgica através de cauterização, como descrito anteriormente,³⁸.
3. Regressão de tumor de monitor e recorrência por imagem bioluminescente. Depois da castração, regressão de tumor ocorrerá dentro de 3 dias e recorrência de tumor ocorrerá dentro de aproximadamente 30 dias, que representa o CRPC.

Resultados

Neste manuscrito, cirurgicamente injetamos a linha celular de câncer de próstata murino, Myc-CaP, no lobo anterior da próstata (figura 1A), levando ao desenvolvimento de tumores de próstata ortotópico com um TME clinicamente relevante e o correto próstata-drenagem dos gânglios linfáticos (figura 1B). Esta foi realizada usando tesouras microdissecando, Graefe fórceps, Graefe fórceps do tecido, um porta-agulha com cortadores de sutura e uma seringa de 50 µ l, com uma agulha de calibre 28 (Figura 1). Após executar um aproximadamente 1 cm da linha média incisão abdominal acima as glândulas prepuciais (Figura 1), uma vesícula seminal e anexado lobo da próstata anterior foram localizados e exteriorizado (Figura 1E) e 30 µ l (1 x 10⁶ células) de um Suspensão de células de PBS/matrigel 1:1 foi injetado a próstata (Figura 1F), inicialmente verificada pelo ingurgitamento do lobo e a falta de escapamento (Figura 1).

Para monitorar o crescimento do tumor ortotópico, nós estàvel transfected células Myc-CaP para expressar tanto luciferase de vaga-lume e mCherry, permitindo a tumores a ser seguido por não-invasivo na vivo bioluminescência (Figura 2A) e fluorescência (Figura 2B), respectivamente. Uma limitação desta imagem é que, dependendo da força do sinal, quantificação de imagem pode saturar enquanto o tumor continua a aumentar de tamanho. Portanto, com intensidades de sinal elevado, esta imagem na vivo é mais útil para normalizar inicialmente fardo de tumor através de grupos experimentais e para depois determinar reduções no tamanho do tumor após tratamentos experimentais. Modalidades de imagem adicionais também podem ser utilizadas, como o pequeno animal, ressonância magnética, PET ou tomografia.

Ortotópico tumores foram dissecados do abdome no dia 30, após a injeção intraprostática (Figura 3A). Ortotópico tumores devem ser localizados no site do lobo anterior da próstata. Tumor massas ao longo do abdômen ou fixada na parede abdominal anterior indicar vazamentos e injeção intraprostática imprópria. Com a técnica adequada, tumor volume (Figura 3B) e peso (Figura 3) podem ser gravadas com o erro-padrão relativamente pequeno. No entanto, como observado, haverá alguma variabilidade com massas de tumor de pequenas e grandes. Portanto, o uso inicial de pré-tratamento de imagem quantificação para equalizar a carga de tumor entre armas experimentais é crítico para todos os experimentos. Além disso, como estas células de câncer murino foram injetadas nos imunocompetentes camundongos FVB/NJ, o TME pode ser analisado por imuno-histoquímica (IHC) ou citometria de fluxo ou de outras técnicas para células T CD3 (Figura 3D) (ou outros tipos de células imunes). Finalmente, este modelo fornece um ponto de extremidade do objetivo de sobrevivência, como o tumor primário grandes causas massa hemorrágica ascite abdominal³⁶ (Figura 3E) e/ou diminuição da deambulação, higiene, e/ou Piloereção³⁷. Ocasionalmente, a morte também pode ser causado pelo crescimento tumoral, bloqueando a saída de urina.

Finalmente, este modelo pode ser utilizado para estudar tanto o câncer de próstata andrógeno-dependentes e o CRPC, o último dos quais confere prognóstico pobre e precisa de opções de tratamento de novela. Após o desenvolvimento do tumor ortotópico, ratos foram cirurgicamente castrados, como descrito anteriormente,³⁸. Como esta é a segunda cirurgia de sobrevivência maior, um cuidado especial deve ser dada para monitorar a recuperação e quaisquer efeitos adversos ou complicações. Dentro de 3 dias após a castração, observou-se regressão do tumor forte, seguido de recorrência do tumor subsequentes após cerca de 30 dias, representando CRPC (Figura 4A). CRPC tumores podem ser dissecação e analisaram histologicamente e não exibem qualquer diferenciação neuroendócrina, como manter altos níveis de AR e são negativos para o marcador neuroendócrino, Sinaptofisina (Figura 4B).

Figura 1: lobo Anterior da próstata, drenagem dos gânglios linfáticos e representante técnica para injeções intraprostática celular. Imagens do (A) lobo da próstata anterior direita (preto, *), anexado a vesícula seminal direita (branco), certo testículo e do tecido (verde) e bexiga (amarelo), (B) bilateral próstata-drenagem pará-aórtica linfonodos (laranja), (C) tesoura microdissecando, Graefe fórceps, Graefe fórceps do tecido, uma porta-agulha com cortadores de sutura e 50 µ l seringa com agulha de calibre 28 (esquerda para a direita), (D) incisões de linha média, vesícula seminal de (E) e lobo anterior da próstata exteriorização, (F), injeção intraprostática e ingurgitamento (G) do lobo anterior da próstata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: No vivo imagem bioluminescentes e fluorescente tumor. (A) e (B) Luciferase - mCherry-expressando tumores ortotópico Myc-CaP foram fotografadas usando um espectro de IVIS Imaging System. Bioluminescência foi quantificada pelo fluxo total (fótons/s). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: análises de tumor ortotópico por tumor volume, peso, histologia para infiltração imune e sobrevivência. Ortotópico tumores foram dissecados no dia 30, após a injeção intraprostática e analisados pelo (A) de imagem, (B) tumor volume bruto (π/6 × L × W × H; L = comprimento do eixo maior do tumor, W = largura perpendicular, H = altura perpendicular), peso de tumor (C) , (D) CD3 IHC (barra de escala = 100 µm) e (E) de sobrevivência, com o ponto de extremidade objetiva como a aparência de hemorrágica abdominal ascite. (A-B) Dados representados como média ± erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: injeções Intraprostática com castração cirúrgica subsequente para modelar tanto o câncer de próstata andrógeno-dependentes e o CRPC. (A) rolamento ortotópico luciferase-expressando tumores de ratos foram pelo bioluminescência pré e pós castração (Cx), e (B) se repetiu CRPC tumores foram dissecados (preto = ortotópico tumor da próstata; amarelo = bexiga) e analisados por H & E, AR IHC e Sinaptofisina IHC (com controlo positivo murino) (barra de escala = 50 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste manuscrito descrevem o protocolo para efectuar injecções de células de câncer prostático intra cirúrgica. Utilizamos o andrógeno-dependentes e MYC -superexpressão (MYC superexpressão é visto acima de 80-90% de câncer de próstata humano³⁹) linha de celular murino câncer de próstata, Myc-CaP, originalmente isolada da Hi-Myc rato^{32 ,33}. Esta linha de celular foi estàvel transfectada para expressar tanto luciferase e mCherry, para não-invasivo na vivo de imagem tumor bioluminescentes e fluorescente, respectivamente. Castração cirúrgica, mais também foi realizada após o desenvolvimento do tumor andrógeno-dependentes, levando à regressão do tumor e posterior reincidência. Portanto, nós fornecemos detalhes para modelar tanto ortotópico câncer de próstata andrógeno-dependentes e CRPC em um host de imunocompetentes.

Células de Myc-CaP foram injetadas lobo anterior da próstata de ratos. A próstata de rato consiste dos lóbulos da próstata dorsolateral, ventrais e anteriores, e a próstata humana consiste em uma zona periférica, zona de transição e zona central dentro de um único lobo⁴⁰. Enquanto estudos prévios anatomicamente e histologicamente compararam o lóbulo dorsolateral do mouse ao periférico humano de zona, o site da maioria dos cancros da próstata⁴¹e o lóbulo anterior do mouse para a zona central humano^{42, 43}, mais recente e abrangente análise demonstrou que o lobo anterior e lobo dorsolateral exibem padrões de expressão de gene intimamente relacionadas, em comparação com o lóbulo ventral. ⁴⁴ contínua, desenvolvimento de câncer de próstata tem sido observado no lobo anterior de gemas⁴⁰, e, para o procedimento intraprostática, o lobo anterior permite a injeção do volume necessário de solução de célula de câncer com vazamento mínimo e variabilidade.

Usando s.c. e transgênica GEM modelos de câncer tem várias falhas e limitações. S.c. tumores cultivados em um TME artificial têm respostas diferenciais para quimioterapias, em contraste com os dois tumores ortotópico da mesma linha de celular e doença humana^20,21,22. Isto pode ser devido a vasculatura alterada de tumores s.c., como exemplificado pela sua resposta diferencial para antiangiogênico terapia^18,19. Pelo contrário, tumores ortotópico desenvolvem com uma adequada TME, drenagem dos gânglios linfáticos e vasculatura e podem ser executadas com linhas de células murino, permitindo desse modo também a análise de Imunologia do tumor e resposta a imunoterapias.

GEMs transgénicas desenvolvem tumores com uma adequada TME em um host de imunocompetentes, no entanto, estes modelos normalmente simplificar câncer humano através do desenvolvimento de tumores com única ou poucas alterações genéticas²⁹. Uma análise de Myc-CaP e outras linhas de células de câncer de próstata revelou que contivessem muito maiores alterações de número de cópia somática e alterações cromossômicas do que tumores de ratos Hi-Myc e outras gemas do qual eles eram derivadas de²⁹. Além disso, gemas são limitadas pelo aumento do custo e tempo necessário para os ratos de reprodução para realizar experimentos de alimentação suficiente. Modelagem de tumor ortotópico pode superar essas limitações. Linhas de células de câncer de próstata humano e murino contêm muitas alterações genéticas relevantes para doenças humanas²⁹e, como câncer humano, mostram também grande heterogeneidade entre as células individuais de³⁰. Ortotópico murino tumores syngeneic permitam análises imunológicas, enquanto ortotópico tumores xenogénicas humanas permitem análises da terapêutica em células humanas. Finalmente, ao contrário com gemas, célula linhas podem ser modificadas antes de injeção, permitindo a expressão de bioluminescentes ou fluorescente de moléculas de imagem para monitorar o crescimento do tumor, normaliza o fardo de tumor entre grupos experimentais, monitorar a resposta ao tratamento e a Siga a regressão do tumor e CRPC recorrência após castração cirúrgica.

Passos críticos neste protocolo incluem a localização e a externalização da vesícula seminal e anexado lobo anterior de próstata sem danificar outros tecidos ou perfuração da vesícula seminal, executando uma bem sucedida injeção intraprostática da 30 µ l de célula suspensão sem escapamento e coletando corretamente quaisquer fugas para prevenir o desenvolvimento de tumor não-ortotópico em todo o abdômen. A grande limitação de injecções intraprostática é atingir a habilidade técnica necessária para minimizar a variabilidade de tumor entre ratos. Isto é especialmente importante para a modelagem de CRPC, que tem a variável adicionada de castração cirúrgica. Intra-prostatically injetados e castrados ratos devem também ser seguidos de perto para recuperação e efeitos adversos, como eles foram submetidos a duas cirurgias de sobrevivência maior. Outra limitação é o momento de cada injeção intraprostática. Isto pode ser reduzido para baixo como 20 min, e o cirurgião assistente pode preparar o mouse próximo como o mouse atual é ser suturado. Finalmente, ortotópico Myc-CaP tumores são agressivos, crescimento rápido tumores que atingem o ponto de extremidade de sobrevivência em aproximadamente 46 dias (e logo em 35 dias) devido o tumor primário em massa. Estudos que exijam mais lento desenvolvimento de tumor ou tratamentos a longo prazo devem ser otimizados empiricamente para o regime de contagem e tratamento de célula injeção inicial. Em contraste com as limitações do s.c. tumores e pedras preciosas, todas as limitações acima do modelo ortotópico tumor podem ser superadas, e modificações adicionais do protocolo podem ser feitas com baseadas nas necessidades individuais de experimentais.

Como o ortotópico modelo tumor envolve o uso de in vitro-células manipuladas, estas células podem ser modificadas dependendo das necessidades do estudo. Aqui, nós modificamos a estas células para expressar estàvel luciferase e mCherry na vivo tumor monitoramento. Também efetuamos um nocaute CRISPR-Cas9 do supressor tumoral PTEN, para gerar uma linha de celular mais agressivo, clinicamente relevantes que cresce mais rápido como tumores ortotópico (manuscrito em revisão). Com as vantagens do modelo de tumor ortotópico, a capacidade de estudar o câncer de próstata andrógeno-dependentes e CRPC e o potencial para expressar as modalidades de imagem ou nocaute ou overexpress selecionados genes, este protocolo serve como um recurso valioso para todos pesquisa sobre o câncer de próstata.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myc-CaP cell line	ATCC	CRL-3255	Verify as mycoplasma-free before use
Micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5910
Graege forceps	Roboz	RS-5135
Graefe tissue forceps	Roboz	RS-5150
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters	FST	12002-12
50 µL Syringe 705 RN SYR	Hamilton	7637-01	Sterilize by ethylene oxide gas
28-gauge Needles Small Hub RN	Hamilton	7803-02	Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas
RPMI	Gibco	18875-093
FBS	Gibco	10437-028
Pencillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
PBS	Gibco	14190-144
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free	Corning	356237	Thaw on ice in 4°C overnight before use
Isoflurane	Henry Schein	11695-0500-2	Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)
26 5/8-gauge syringe	BD	309597	For meloxicam and buprenorphine injections
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL		12496-0757-5	Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM
Ophthalmic ointment lubrication	Akron	17478-162-35
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)	Purdue Products	67618-151-16
Sterile non-adhering pads	Moore Medical	10775
Sterile alcohol wipes	Fisher Scientific	22-363-750
Surgical microscope Stemi DV4	Zeiss
Sterile polyester tipped applicators	Puritan	25-806 1PD
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures	eSutures	J493G
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures	eSutures	699H
Glass bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Sterile saline 0.9% sodium chloride	Hospira	0409-4888-02
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL	Henry Schein	11695-6925-1	Acquired from Northwestern University CCM
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate	Goldbio	LUCNA
IVIS Spectrum Imaging System	PerkinElmer
Cauery surgical pen	Bovie Medical Corporation	AA01
CD3ε antibody (clone 2GV6)	Ventana	790-4341
Caliper	Fisher Scientific	14-648-17
Androgen receptor antibody	Thermo Scientific	RB-9030-P1	1:500 staining dilution
Synaptophysin antibody (clone Z66)	Life Technologies	18-0130	1:200 staining dilution