발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

요약

이 프로토콜의 목표 후속 거세와 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 설명 하는 것입니다. 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암의 Orthotopic 전 임상 모델은 임상 관련 종양 microenvironment 및 immunocompetent 호스트의 컨텍스트에서 질병 연구에 중요 한.

초록

여러 이점이 둘 다 피하는 하 고 유전자 변형 유전자 조작 마우스 모델 Orthotopic 종양 모델링은 전 임상 전립선 암 연구를 위한 유용한 도구입니다. 피하 종양, 달리 orthotopic 종양 임상 더 정확한 맥 관 구조, 종양 microenvironment, 및 여러 치료에 대 한 응답을 포함. 반면 유전자 조작된 마우스 모델, orthotopic 모델 저렴 한 비용으로 수행할 수 있습니다 및 더 적은 시간에서 매우 복잡 하 고 유형이 다른 마우스 또는 인간 암 세포 선의 사용을 포함 오히려 그 단일 유전 변경, 그리고이 셀 라인 수정할 수 있습니다 유전자, 표현 이미징 에이전트와 같은. 여기, 선물이 수술 쥐의 앞쪽 전립선 엽 luciferase mCherry 표현 murine 전립선 암 세포 라인을 주입 하는 프로토콜. 이러한 마우스 개발 orthotopic 종양을 비 접촉 모니터링 vivo에서 더욱더 종양 양, 무게, 마우스 생존, 및 면역 침투에 대 한 분석. 또한, orthotopic 종양 방위 쥐 했다 수술 거세, 즉시 종양 회귀 및 연속적인 재발, 대표 하는 거세 내성 전립선 암. 기술이이 절차를 수행 하는 데 필요한, 하지만이 syngeneic orthotopic 모델 모두 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암 분야에서 모든 조사를 위대한 사용입니다.

서문

전립선 암은 높은 발생률 (161,360 남자) 하 고 2017¹(84,590 남자) 제 3 대부분 남성 암 사망 원인으로 추정 된다. 진단 되 면, 전립선 종양 androgen 종속 되며 전립선 수술, 방사선 요법, 그리고 androgen 부족 요법은 (대서양 서머 타임)에 의해 처리 됩니다 아직 각 치료 관련 여러 주요 morbidities 및 합병증^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. 종양 회귀 ADT 후,에 불구 하 고 거의 모든 종양 재발 거세 내성 전립선 암 (CRPC). 이 단계에서 승인 된 치료 포함 docetaxel, Sipuleucel-T immunotherapy, 안티 androgen 작은 분자 enzalutamide 및 abiraterone, 아직 아무 개별 치료 5.2 개월^11, 보다는 더 많은 것의 생존 혜택 수 여 ^{12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}. 전립선 암의 모든 단계에서 남자 향상 된 치료 옵션 및 morbidities, 어떤 최적의 전 임상 질병에 대 한 모델링은 중요 한 관리를 필요로 하는 따라서.

올바른 절차와 전립선 암 세포 라인 수술 두 syngeneic 또는 xenogeneic orthotopic 종양의 개발으로 이어지는 murine 전립선으로 얻은 될 수 있다. Orthotopic 종양 모델링은 모든 종양 생물학 및 약물 개발 연구, 임상 대표적인 종양 microenvironment (TME)와 종양 개발에 대 한 허용 합니다. 이전 연구는 피하 (사우스 캐롤라이나) 종양은 변경 된 종양 맥 관 구조, 안티-신생 요법^18,19차동 및 더 적은 임상 정확한 응답에 지도 증명 하고있다. 또한, 여러 연구 관찰 치료 여부에 따라 동일한 셀 라인에 여러 chemotherapeutics의 증가 또는 감소 효능 관리 사우스 캐롤라이나 또는 orthotopically, 후자는 최고의 인간에서 본 것 표현 암^20,,2122. 또한, 대 장 암의 orthotopic 모델에만 하지만 사우스 캐롤라이나 모델에 종양 생성 않았습니다 전이²³을 유도 하는 데 필요한 올바른 degradative 효소. 마지막으로, immunotherapies 계속 암 치료의 최전선에 등장 하 고 특히 그들은 아직 전립선 암^24,25, 정확한 TME syngeneic 전 임상 모델에 대 한 상당한 혜택을 제공 하 고 immunocompetent 호스트 드레이닝 림프절은 중요 합니다.

종양 사이트에 따라 이러한 일관성 없는 결과 대 한 책임 여러 가지 요인 있다. 다른 TME 암 세포 다른 조직 관련 endothelium에 노출 되 고 신생, 종양 개발^26,27에 따라서 영향을 미치는 변경. 올바른 TME Orthotopic 종양 임상 관련 약물 전달, hypoxic 조건, 및 안티-신생 치료²⁸의 평가 대 한 수 있습니다. 종종 번 식, 높은 비용, 고 대 한 번 기 절 또는 임상 관련 수준을 넘어 overexpressed 단일 또는 몇 가지 유전자의 조작에 따라 유전자 조작된 모델 (보석) 그들은 오랫동안 필요로 하는 정확한 TME 포함 할. 반면, 인간 또는 murine 전립선 암 세포 선 인간의 종양 같은 orthotopic 종양에 사용 되는 단일 세포 내와 세포^29,30사이 성분 표시에 훨씬 더 많은 유전자 복잡 합니다. 또한 보석, 달리 orthotopic 암 세포 라인 이미징 modalities를 표현 하기 위해 설계 되었습니다 하거나 수 증가 또는 관심, 그리고 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험 결과의 다른 분자의 감소 수준을 직접 비교할 수 있습니다. Orthotopic 종양 또한 기본 환자 파생 된 세포에서 형성 수 있습니다. 여기, 우리 보고 orthotopic androgen 종속 종양을 형성 하 고, 거세, 후 orthotopic CRPC로 재발 하는 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 수행 하기 위한 방법론.

프로토콜

이 프로토콜에서 설명 하는 동물 절차의 모든 윤리 규정 및 적절 한 대학 기관 동물 관리의 승인 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 수행할 수 있습니다.

1. 수술 재료와 암 세포의 준비

1. 전에 수술, 고압 마이크로 해 부가 위, Graefe 집게, Graefe 조직 집게, 봉합 절단기, 바늘 홀더의 날 그리고 커튼의 적절 한 수 있습니다. 에틸렌 산화물 가스 (그림 1C)에 의해 50 µ L 주사기와 28 게이지 바늘을 소독.
2. 전에 수술, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 (P/S) 37 ° C 5% CO₂ 배양 기에서 보충 RPMI에 10 cm 요리에서 문화 Myc 캡 셀의 하루. 발광 및 형광 종양 모니터링, 적절 한 벡터와 293T 세포 transfect 고 이후에 transduce 0.45 μ m 필터링 lentivirus³¹Myc 캡 셀. 100% 변환 양성으로 안정적인 셀 라인을 생성 하는 셀을 정렬 합니다.
   참고: 모든 조직 문화 무 균 조건 하에서 수행 하 고 모든 셀 라인 mycoplasma 무료 있는지 확인 합니다. Myc 모자³²,이 연구에 활용 murine 전립선 암 세포 선으로 안정적으로 반딧불 luciferase과 mCherry 불리고는. C-myc에서 격리 Myc 캡 셀 라인 iss-overexpressing이 myc 마우스 및 이러한 셀 포함 증폭된 androgen 수용 체 (AR), 안 드로 겐 의존³² 고 murine 거세³³후 CRPC 종양을 형성. 이 연구에서 모든 마우스는 6-8 주 오래 된 남성 FVB/뉴저지 쥐. 대체 murine 전립선 암 세포 선 immunodeficient 마우스 함께 적절 한 유전 배경으로 인간의 전립선 암 세포 선 또는 기본 환자 파생 전립선 암 세포의 마우스와 함께 사용할 수 있습니다. 최적의 주입 당 셀 수 대체 셀 라인에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다. 또한, 대안 이미징 형식 종양, 자기 공명 영상 (MRI), 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 또는 계산 된 단층 촬영 (CT)를 포함 하 여 mCherry 대신 GFP 뿐만 아니라 시각화를 활용할 수 있습니다.
3. 수술 전날 밤 matrigel 지하실 멤브레인 매트릭스와 페 놀 레드 무료에 얼음 해 동 4 ° C에서 배치 합니다.
4. 수술 당일에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 그들을 세척 하 고 0.25 %trypsin-EDTA와 분리 하 여 세포를 수집 합니다. 10 %FBS 1%와 RPMI trypsin 중화 P/s.
5. 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 원심
6. FBS 또는 P/미 없이 RPMI의 10 mL로 세포 세척
7. 셀을 계산 하 고 resuspend 6.67x10⁷ 셀/mL (1 × 10⁶ 셀/15 µ L)의 농도에 PBS에 셀.
8. 1 × 10⁶ 셀/30 µ L의 최종 농도에 1:1 PBS/matrigel 세포 현 탁 액을 만들려고 matrigel의 동일한 볼륨을 추가 하 고 응고를 방지 하기 위해 주입까지 얼음에 셀을 계속.
   참고: 준비 matrigel 셀 정지 3 h 이내 내 전립선 주사를 수행 합니다. 5 개 이상의 쥐에 내 전립선 주사를 수행 하는 경우 신선한 matrigel 세포 현 탁 액을 준비 하는 위의 단계를 반복 합니다.

2. 수술 마우스 준비

참고: 대학 동물 시설에서 수술을 하기 전에 적어도 1 주일에 대 한 적절 한 적응을 위해 허용 하 고 동물의 스트레스를 최소화 하기 위해 집 쥐. 2.1 2.6 단계는 외과 의사 조 수에 의해 수행 됩니다. 모든 후속 수술 단계 살 균 기술로 무 균 장갑과 수술 도구를 사용 하 여 외과 의사에 의해 수행 됩니다.

1. Isoflurane (챔버를 통해 유도 2-5%, 코 콘을 통해 유지 보수에 대 한 1-3%)와 마우스 anesthetize 발가락 핀치 반사의 손실에 의해 전체 유도 확인 합니다.
2. 쥐 무게 진통 buprenorphine의 적어도 0.05 mg/kg를 관리 하 고 사우스 캐롤라이나
   참고: 마우스 무게 ≥20 g 성공적인 내 전립선 주사에 이상적입니다.
3. 안과 연 고 윤 활 양쪽 눈 각 막 건조 방지 하기 위해 적용 됩니다.
4. 복 부에서 모든 털을 면도.
5. 무 균 알코올 잎사귀 뒤 살 균 비 준수 패드를 사용 하 여 수술 스크럽의 원형 응용의 3 라운드로 복 부를 소독. 복 부 건조를 허용 합니다.
   주: 수술 절차의 나머지 부분에 대 한 멸 균 장갑과 수술 도구 수 문의 소독된 마우스 복 부.
6. 깨끗 한 수술 현미경의 목적은 바로 아래 난방 패드에 깨끗 한 표면에 부정사 마우스를 전송 합니다.
7. 작은 구멍 커트가 복 부 살 균 드 레이프와 마우스를 커버.

3. 내부 전립선 주입

참고: 무 균 조건 하에서 모든 수술 단계를 수행 합니다. 현미경, 마우스 배치, 또는 조정 기타 비 멸 균 개체 외과 의사 조 수에 의해 수행 되어야 합니다.

1. 수행 된 우수한 음을 preputial 동맥 (그림 1D) 복 부의 중간 선 따라 외부 피부의 약 1 cm 절 개.
2. 레이어 사이가 위를 열어 결합 조직 외부 복 부 피부와 내부 복 부 근육 사이 구분 합니다.
3. 창 자 또는 방광 (그림 1D)를 puncturing 피하려고 근육 인상 집게를 사용 하는 동안 내부 복 부 근육의 비슷한 절 개를 수행 합니다.
4. 양자 정액 소포 (그림 1A, 흰색) 중 하나를 찾습니다/앞쪽 전립선 엽 (그림 1A, 블랙), 후부, 측면, 그리고 방광 (그림 1A, 노랑), 하지만이 약간 우수한 자주는 쥐 사이 다를 수 있습니다. . 앞쪽 전립선 돌출부는 반투명 흰색 정액 소포의 낮은 곡률에 연결 된.
5. 부드럽게 puncturing 정액 소포 (그림 1E) 하지 않고 조직에 긴장을 만들 Graefe 조직 집게를 사용 하 여 정액 소포의 팁을 올립니다.
6. 혼합 Myc 모자 matrigel 솔루션 이방인 pipetting (외과 의사 조 수에 의해 수행)로 셀 pelleted 할 수 있습니다, 천천히 공기 방울을 피하기 위해 바늘으로 30 µ L (1 x 10⁶ 셀)를 발음 하는 고.
7. 조심 스럽게 앞쪽 전립선 엽의 긴 축에 바늘 병렬의 경사를 삽입 합니다. 엽으로 30 µ L를 천천히 주입 하 고 천천히 누설 (그림 1 층)을 방지 하기 위해 바늘을 철회. 앞쪽 전립선 엽 (그림 1G)의 engorgement에 의해 적절 한 주입을 확인 합니다.
8. 조심 스럽게 잡고 정액 소포와 대략 30에 대 한 마우스 외부 주입된 전립선 엽 부분적으로 엽 내 응고 matrigel 있도록 s. 이 시간 동안 멸 균 폴 리 에스테 르 밀고 주걱을 사용 하 여 주입된 전립선 엽에 누르지 않고 비 orthotopic 종양 개발을 방지 하기 위해 복 부에 어떤 셀 솔루션 누설을 수집 합니다.
9. 조심 스럽게 반환 정액 소포 및 주사 전립선 엽 복 부에는 엽에 압력을 주지 않고. 대체 어떤 외부화 조직.
10. 5-0 vicryl 흡수 역 절단 바늘 봉합 내부 복 부 근육을 연속 봉합을 수행 합니다.
11. 4-0 나일론 monofilament 비 흡수 역 절단 바늘 봉합 외부 복 부 피부를 닫습니다 중단된 봉합을 수행 합니다.
    참고: 멸 균된 9 mm 스테이플 또한 외부 복 부 피부를 사용할 수 있습니다. 그러나, 봉합, 달리 그들은 모든 후속 발광 및 형광 종양 영상 신호 방해 합니다.
12. ()를 열어 외과 의사 보조 살 균 에탄올 잎사귀와 함께 모든 도구를 청소 하 고 마우스를 사용 하기 전에 건조 도구 30 s. 허용에 대 한 유리 구슬 살 균 기에 넣어.
13. 나머지 matrigel에 의해 막힘을 방지 하기 위해 주사기와 멸 균 식 염 수 ()를 열어 외과 의사 조 수에서에서 바늘을 플러시.
    참고: 외과 의사 보조 해야 합니다 모든 작업에 대 한 존재 혼합 주사 전에 Myc 모자 matrigel 솔루션으로 모든 비-불 임 수술 마우스 준비와 수술 마우스 케어. 시간을 최소화, 각 내부 전립선 마우스 절차는 20-30 분을 요구할 것 이다로, 외과 의사 보조 외과 의사는 현재 마우스를 봉합으로 다음 마우스를 준비 시작할 수 있습니다.

4. 수술 마우스 케어

1. 1 mg/kg 진통 meloxicam의 관리 즉시 사우스 캐롤라이나, 24 h, 그리고 수술 후 48 h.
2. 쥐 없는 침구 난방 패드에 중간 위치에 복구할 수 있습니다. 때까지 그들은 다시 정상 성과 활동, 후 감 금 소의 바닥에 음식 가진 깨끗 한 감 금 소에는 수술 후 적어도 30 분 동안 쥐를 모니터링 합니다.
3. 또한 수술 후 매일 적절 한 상처 치유, 몸 무게, 손질, 및 ambulation에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 싸움의 증거에 따라 개별 연습장으로 별도 마우스.
4. 수술 후 14 일 이내 모든 나머지 봉합을 제거 합니다.

5. 발광 종양 영상

1. 살 균 필터링 Na⁺ 또는 K⁺ 제조 업체에 의해 설명 하 고 빛에서 보호로, D-소를 준비 합니다.
2. 소의 몸 무게의 10 µ L/g와 intra-peritoneally 마우스를 주입할 수 있습니다.
3. 적어도 10 분 후, IVIS 스펙트럼 이미징 시스템, 이미지 마우스 이전^34,35설명.
4. 앞에서 설명한^34,35생활 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.
   참고: 이미징 분석 IVIS 성공적인 전립선 내 주사 및 실험적인 그룹 간의 종양 부담 정상화를 초기 종양 개발을 결정 하는 데 유용 합니다. 그러나, 발광 또는 형광 신호 강도 따라 포화 될 수 있습니다 고원 실제 종양 크기에서 증가도 불구 하 고 이미지 정량화. 따라서, 종양 성장의 나중 단계에서 IVIS 이미징 이미지 채도 후 성공적인 치료 시 종양 크기의 감소 보다는 크기에서 증가 확인 하기 위해 더 유용할 수 있습니다.

6. 종양 컬렉션, 종양 분석, 생존 끝점

1. 분석에 대 한 종양을 수집, CO₂ 노출 및 보조 자 궁 경관 탈 구, 또는 대체 IACUC 승인 방법으로 마우스를 안락사 하 고 해 부 복 부에서 종양 고통 없이. 종양에는 전립선에 위치 orthotopically 이어야 한다.
   참고: 종양 전방 복 벽에 연결 된 또는 복 부에 걸쳐 시드 가난한 또는 새 내 전립선 주입, 나타내고 orthotopic 종양으로 간주 되지 해야 합니다.
2. 종양의 무게.
3. 계산 종양 볼륨으로 π/6 × L × W × H (L = 종양, W의 가장 긴 축의 길이 = 수직 너비, H = 수직 높이).
4. 종양 조직학 (10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 수정)에 의해 분석 될 수 있다, cytometry 흐름 (단일 셀 정지를 만들기), 단백질 (RIPA 버퍼에서 lysate 조직 준비), 또는 RNA (RNAlater에 즉시 장소 조직).
5. 면역 분석, 전립선 종양 배출 파라 대동맥 림프절 (그림 1B, 오렌지)와 비장 수집 또한.
   참고: 만약 마우스 생존에 대 한 다음,이 모델의 끝점 출혈 복 부 ascites³⁶ 의 모양으로 정의 및/또는 ambulation, 손질, 및 piloerection³⁷을 감소. 마우스 생존 분석에 대 한 사전 및 수술 후 진통 (프로토콜 단계 2.2, 4.1)를 수신 하 고 정기적으로 모니터링 해야 합니다. 어떤 싸움 발생 경우, 위의 끝점 표시기의 모양을 따라 고통 없이 안락사 해야 쥐 개별 연습장으로 분리 되어야 한다.

7. 외과 거세 CRPC를

1. CRPC를, 수행 위의 내 전립선 주입 프로토콜 (프로토콜 단계 1-5).
2. 적어도 1 주일 후, 종양 개발 후 앞에서 설명한³⁸서 열화를 통해 외과 거세를 수행 합니다.
3. 발광 영상으로 종양 회귀 및 재발을 모니터링 합니다. 거세, 후 종양 회귀 3 일 이내 발생 하 고 종양 재발 CRPC 대표 약 30 일 이내에 발생 합니다.

결과

이 원고에서 우리 수술 주입 murine 전립선 암 세포 선, Myc-모자, (그림 1A), 이전 전립선 엽으로 임상 관련 TME와 올바른 orthotopic 전립선 종양의 개발으로 이어지는 전립선 배출 림프 노드 (그림 1B). 이 28 게이지 바늘 (그림 1C) 마이크로 해 부가 위, Graefe 집게, Graefe 조직 집게, 봉합 절단기, 바늘 홀더 및 50 µ L 주사기를 사용 하 여 수행 되었다. 약 1 cm 중간 복 부 절 개 preputial 동맥 (그림 1D) 위에, 1 개의 정액 소포 및 연결 된 앞쪽 전립선 엽 위치 및 (그림 1E) externalized 후 수행과의 30 µ L (1 x 10⁶ 세포)는 1:1 PBS/matrigel 세포 현 탁 액은 전립선 (그림 1 층), 엽의 engorgement와 누설 (그림 1G)의 부족에 의해 처음으로 확인에 주입 했다.

모니터링 orthotopic 종양의 성장, 우리 안정적으로 페 Myc 모자 셀으로 반딧불 luciferase과 mCherry, 비-침략 적 vivo에서 생물 발광 (그림 2A) 및 형광 (그림 뒤에 종양에 대 한 허용 2B), 각각. 이 영상의 한 한계는, 신호의 강도 따라 정량화 이미징 수 포화 종양 크기에서 증가 하 고 있는 동안 이다. 따라서, 높은 신호 강도 가진이 vivo에서 화상 진 찰은 처음 실험 그룹 간에 종양 부담을 정상화 하 고 나중에 실험적 치료 후 종양 크기에서 감소를 결정 더 유용 합니다. 추가적인 이미징 형식 또한 이용 될 수 있다, MRI, 애완 동물, 또는 코네티컷 작은 동물 등

Orthotopic 종양 복 부에서 전립선 내 주사 (그림 3A) 후 30 일에는 해 부 했다. Orthotopic 종양 앞쪽 전립선 엽의 사이트에 위치 해야 합니다. 종양은 복 부에 걸쳐 대 중 또는 전방 복 벽에 부착 된 부적 절 한 내 전립선 주입 및 누설을 나타냅니다. 적절 한 기술, 종양 볼륨 (그림 3B)와 무게 (그림 3C) 상대적으로 적은 표준 오류를 기록할 수 있습니다. 그러나, 관찰, 크고 작은 종양 질량을 가진 어떤 변화 있을 것입니다. 따라서, 실험 무기 간의 종양 부담을 맞춰야 전처리 영상 정량화의 초기 사용은 모든 실험에 대 한 중요 합니다. 또한, 이러한 murine 암 세포 immunocompetent FVB/뉴저지 쥐로 주입 했다로 TME CD3 T 세포 (그림 3D) (또는 다른 면역 세포 유형) immunohistochemistry (IHC) (또는 cytometry 또는 다른 기술)에 의해 분석할 수 있습니다. 마지막으로,이 모델 (그림 3E) 대형 기본 종양 질량 원인 출혈 복 부 ascites³⁶ 으로 객관적인 생존 끝점을 제공 하거나 ambulation, 손질, 및 piloerection³⁷감소 합니다. 때때로, 죽음 또한 소변 출력을 차단 하는 종양 성장에 의해 발생할 수 있습니다.

마지막으로,이 모델은 androgen 종속 전립선 암 CRPC, 후자는 빈약한 예 지를 수 여 하 고 새로운 치료 옵션의 필요를 모두 공부 하 고 활용할 수 있습니다. Orthotopic 종양 개발 후 마우스 했다 수술 거세, 앞에서 설명한³⁸로. 이것이 두 번째 주요 생존 수술, 여분 배려 복구 및 부작용 또는 합병증에 대 한 모니터링을 제공 합니다. 거세 후 3 일 이내 강한 종양 회귀 CRPC (그림 4A) 대표 약 30 일 후 후속 종양 재발 다음 관찰 되었다. CRPC 종양 조직학, 분석 그리고 그들은 높은 아칸소 수준을 유지 하 고 neuroendocrine 마커, synaptophysin (그림 4B)에 대 한 부정적인 어떤 neuroendocrine 차별화를 표시 하지 않습니다 해 부 될 수 있다.

그림 1: 앞쪽 전립선 엽, 배수 림프 노드 및 내부 전립선 세포 주사에 대 한 대표적인 기술. (A) 오른쪽 앞쪽 전립선 엽의 이미지 (검정, *), 오른쪽 정액 소포 (흰색), 오른쪽 고환 및 지방 패드 (녹색), 방광 (노란색), (B) 양자 전립선 배출 파라 대동맥 림프절 (오렌지), (C)를 첨부 마이크로 해 부가 위, Graefe 집게, Graefe 조직 집게, 봉합 절단기, 바늘 홀더 및 28 게이지 바늘 (왼쪽), (D) 중간 절 개, (E) 정액 소포와 앞쪽 전립선 엽 50 µ L 주사기 외부화, (F), 내 전립선 주입, 및 (G) engorgement 앞쪽 전립선 엽의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: vivo에서 발광 및 형광 종양 영상. (A) Luciferase-와 (B) mCherry-표현 orthotopic Myc 모자 종양 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있었다. 생물 발광은 총 속 (광자/s)에 의해 정량 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 종양 부피, 무게, 면역 침투, 및 생존을 위한 조직학 Orthotopic 종양 분석. Orthotopic 종양 내 전립선 주사 후 30 일에 해 부 되었고 분석 (A) 총 영상, (B) 종양 볼륨 (π/6 × L × W × H; L = 종양, W의 가장 긴 축의 길이 = 수직 너비, H = 수직 높이), (C) 종양 무게, (D) CD3 IHC (눈금 막대 = 100 µ m), 그리고 복 부 출혈의 모습으로 객관적인 끝점 (E) 생존 ascites입니다. (A-B) 평균 ± 표준 오차의 의미로 표현 하는 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 내부 전립선 주사 androgen 종속 전립선 암과 CRPC를 후속 외과 거세. (A) orthotopic luciferase 표현 종양 방위 쥐 했다 생물 발광 사전 및 사후 거세 (Cx)에 의해 몇 군데와 (B) 재발 CRPC 종양 했다 해 부 (검은 orthotopic = 전립선 종양, 노란색 = 방광) H 분석 & E, 아칸소 IHC, 및 (와 함께 긍정적인 murine 제어) synaptophysin IHC (눈금 막대 = 50 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 원고에서 우리 외과 내 전립선 암 세포 주사를 수행 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 안 드로 겐 의존 및 MYC-overexpressing 활용 (MYC overexpression 볼까지 인간 전립선 암³⁹의 80-90%) murine 전립선 암 세포 선, Myc-모자, 원래이 Myc 마우스^{32 에서에서 격리 33}. 이 셀 라인 luciferase와 발광 및 형광 종양 영상 비-침략 적 비보에 대 한 mCherry를 각각 표현 하 불리고 안정적 이었다. 더, 외과 거세 또한 androgen 종속 종양 개발, 종양 회귀 및 연속적인 재발 후 수행 되었다. 따라서, 우리는 세부 모델 orthotopic androgen 종속 전립선 암 및 CRPC immunocompetent 호스트에 제공 합니다.

Myc 캡 셀 쥐의 앞쪽 전립선 엽에 주입 했다. 마우스 전립선 앞쪽, 복 부, 그리고 dorsolateral 전립선 엽의 구성 되어 있으며 인간의 전립선 주변 영역, 과도 영역 및 단일 엽⁴⁰내의 중앙 영역 구성 됩니다. 이전 연구는 해부학과 조직학 비교 인간의 주변에 dorsolateral 마우스 엽 동안 구역, 전립선 암⁴¹의 대부분과 이전 마우스 엽 인간의 중앙 영역^42, 의 사이트 ⁴³, 더 최근과 포괄적인 분석 앞쪽 엽과 dorsolateral 엽 복 부 엽에 비해 밀접 하 게 관련된 유전자 표현 패턴 표시를 보여주었다. ⁴⁴ 추가, 전립선 암 개발 보석⁴⁰, 앞쪽 엽에서 관찰 되었습니다. 그리고 내 전립선 절차에 대 한 최소한의 누설 암 세포 솔루션의 필요한 볼륨의 주입을 위해 앞쪽 엽 수 그리고 다양성입니다.

사우스 캐롤라이나 및 유전자 변형 보석을 사용 하 여 암 모델은 여러 개의 결함 및 제한. 인공 TME에서 성장 하는 사우스 캐롤라이나 종양 같은 셀 라인 및 인간 질병^20,,2122에서 두 orthotopic 종양 달리 chemotherapies 차동 응답 있다. 이 안티-신생 치료^18,19차동 반응에 의해 exemplified로 사우스 캐롤라이나 종양의 변경된 맥 관 구조 때문일 수 있습니다. 그와 반대로, orthotopic 종양 적절 한 TME, 배출 림프절 및 맥 관 구조, 개발 하 고 murine 셀 라인, 그로 인하여 또한 종양 면역학 및 immunotherapies에 대 한 응답의 분석에 대 한 수 있도록 수행할 수 있습니다.

유전자 변형까지 개발 된 immunocompetent 호스트에 적절 한 TME 종양 아직 이러한 모델은 일반적으로 단일 또는 몇 가지 유전 변경²⁹와 종양을 개발 하 여 인간의 암을 지나치게 단순화. Myc 모자 및 다른 전립선 암 세포 라인의 분석은 그들은 훨씬 더 큰 체세포 복사 번호 변경 및 종양이 Myc 마우스 및 어떤에서 그들이 파생된²⁹다른 보석 보다 염색체 변경 포함 된 밝혔다. 또한, 보석 쥐 충분 한 전력의 실험을 수행 하기 위해 번 식에 필요한 시간과 비용 증가 의해 제한 됩니다. Orthotopic 종양 모델링은 이러한 한계를 극복할 수 있다. 인간과 murine 전립선 암 세포 선 인간의 질병²⁹, 관련이 많은 유전 변경 포함 하 고, 인간의 암 처럼 표시 또한 개별 셀³⁰사이 좋은. Orthotopic murine syngeneic 종양 면역 분석에 대 한 허용 orthotopic 하면서 인간의 xenogeneic 종양 허용 인간 세포에 치료제의 분석. 마지막으로,와 달리 보석, 셀 라인 주입, 종양 성장, 모니터 발광 또는 형광 분자 이미징의 표현에 대 한 수 있도록 표준화 실험 그룹 간의 종양 부담 하기 전에 수정할 수 있습니다 모니터링, 처리 하 고 응답 따라 종양 회귀와 외과 거세 후 CRPC 되풀이 합니다.

이 프로토콜의 중요 한 단계를 찾는 등 다른 조직 손상 또는 세포의 30 µ L의 성공적인 내부 전립선 주사를 수행 정액 소포를 puncturing 없이 정액 소포와 연결 된 앞쪽 전립선 엽을 외부화 누설, 그리고 복 부에 걸쳐 비 orthotopic 종양의 개발을 방지 하기 위해 어떤 누설을 제대로 수집 하지 않고 현 탁 액. 내 전립선 주사의 주요 한계 쥐 사이 종양 변화를 최소화 하는 데 필요한 기술을 달성 이다. 이 외과 거세의 추가 변수가 CRPC 모델링에 대 한 특히 중요 하다. 내 prostatically 주입 하 고 거세 쥐 해야 합니다 또한 따라야 밀접 하 게 복구 및 불리 한 이벤트에 대 한 그들은 두 개의 주요 생존 수술 받은 대로. 또 다른 한계는 각 내부 전립선 주입의 시간 이다. 이 감소 될 수 있다을 최저 20 분, 그리고 외과 의사 조 수 준비 다음 마우스 현재 마우스 봉합 되 고. 마지막으로, orthotopic Myc 모자 종양 공격적, 빨리 성장 하 고는 생존 끝점 약 46 일에서 (35 일) 기본 종양 때문에 도달 하는 종양 질량입니다. 느린 종양 개발 또는 장기 치료를 필요로 하는 연구 초기 주입 세포 수 및 치료 처방에 대 한 경험적으로 최적화 되어야 합니다. 사우스 캐롤라이나 종양 및 보석의 한계, 달리 모든 orthotopic 종양 모델의 위의 한계 극복 될 수 있다, 그리고 프로토콜의 추가 수정 개별 실험 요구 사항에 따라 만들 수 있습니다.

orthotopic로 종양 모델 생체 외에서의 사용을 포함-처리 셀,이 연구의 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 여기, 우리는 안정적으로 luciferase vivo에서 종양 모니터링을 위한 mCherry을 표현 하는이 세포 수정. 우리는 또한 종양 억제기 PTEN, orthotopic 종양 (원고 검토에서)로 빠르게 성장 하는 공격적인, 임상 관련 셀 라인을 생성 하는 CRISPR Cas9 녹아웃을 수행 했습니다. Orthotopic 종양 모델, androgen 종속 전립선 암 CRPC, 및 이미징 형식 또는 최저 또는 overexpress 선택 유전자 표현을 공부 하는 능력의 장점으로이 프로토콜 모두를 위한 귀중 한 자원으로 역 전립선 암 연구입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myc-CaP cell line	ATCC	CRL-3255	Verify as mycoplasma-free before use
Micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5910
Graege forceps	Roboz	RS-5135
Graefe tissue forceps	Roboz	RS-5150
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters	FST	12002-12
50 µL Syringe 705 RN SYR	Hamilton	7637-01	Sterilize by ethylene oxide gas
28-gauge Needles Small Hub RN	Hamilton	7803-02	Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas
RPMI	Gibco	18875-093
FBS	Gibco	10437-028
Pencillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
PBS	Gibco	14190-144
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free	Corning	356237	Thaw on ice in 4°C overnight before use
Isoflurane	Henry Schein	11695-0500-2	Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)
26 5/8-gauge syringe	BD	309597	For meloxicam and buprenorphine injections
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL		12496-0757-5	Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM
Ophthalmic ointment lubrication	Akron	17478-162-35
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)	Purdue Products	67618-151-16
Sterile non-adhering pads	Moore Medical	10775
Sterile alcohol wipes	Fisher Scientific	22-363-750
Surgical microscope Stemi DV4	Zeiss
Sterile polyester tipped applicators	Puritan	25-806 1PD
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures	eSutures	J493G
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures	eSutures	699H
Glass bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Sterile saline 0.9% sodium chloride	Hospira	0409-4888-02
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL	Henry Schein	11695-6925-1	Acquired from Northwestern University CCM
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate	Goldbio	LUCNA
IVIS Spectrum Imaging System	PerkinElmer
Cauery surgical pen	Bovie Medical Corporation	AA01
CD3ε antibody (clone 2GV6)	Ventana	790-4341
Caliper	Fisher Scientific	14-648-17
Androgen receptor antibody	Thermo Scientific	RB-9030-P1	1:500 staining dilution
Synaptophysin antibody (clone Z66)	Life Technologies	18-0130	1:200 staining dilution