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요약

유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

초록

생명체는 온도, pH, 반응 산소 종의 축적 등에서 변화를 포함 하 여 그들의 수명 주기 동안 환경 변동에 대처 하기 위해 정기적으로 필요 합니다. 이러한 변동 광범위 한 단백질 전개, 집계,으로 이어질 수 있으며 세포 죽음. 따라서, 세포 스트레스 조건 중 "건강 한" 프로테옴을 유지 하는 분자 보호자의 역동적이 고 스트레스 관련 네트워크를 진화 했다. ATP-독립 보호자 일선 방위 분자, 스트레스-종속 방식에서 단백질 집계에 대 한 보호로 봉사 하는 분자 보호자의 1 개의 주요 클래스를 구성 합니다. 한 이러한 보호자 공통점 기능은 그들의 스트레스 관련 활성화, 인식 및 misfolded 클라이언트의 버전에 대 한 구조적인가 소성을 활용 하는 능력.

이 문서에서 우리는 한 그러한 본질적으로 무질서 보호자, 단백질 산화 스트레스 동안 집계에 대 한 보호는 세균성 산화 규제 Hsp33의 기능 및 구조 분석에 집중 한다. 여기, 선물이, 보호자의 구조적 변화를 매핑 뿐만 아니라 보호자 redox 규제 활동, 공부에 대 한 다양 한 기술의 도구 상자 밑에 그것의 활동. 특히, 우리는 보호자 안티 집계 활동에서 생체 외에서 빛 산란을 사용 하 여의 정도에 초점을 맞추고의 분석 이어서 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비를 포함 하는 워크플로 설명 합니다 반대로 집계 활동과 그 활동입니다. 극복 하기 위해 자주 outliers 집계 분석 하는 동안 축적 된, Kfits, 운동 측정의 쉬운 처리를 수 있는 새로운 그래픽 도구 사용을 설명 합니다. 이 도구는 쉽게 다른 유형의 outliers를 제거 및 운동 매개 변수 피팅 운동 측정에 적용할 수 있습니다. 단백질 구조와 기능을 연결할 설치 및 워크플로 구조 질량 분석 기술, 수소 중수소 교환 질량 분석, 구조적 변화의 매핑은 보호자 수의 설명 및 Hsp33 활동의 다른 단계 동안 있는 기질 다른 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호 작용에는 동일한 방법론을 적용할 수 있습니다.

서문

셀 자주 발생 하는 반응성 산소 종 (선생님)의 호흡1,2, 단백질 및 지질 산화3,4및 추가 프로세스5, 부산물 생산의 축적 6,7. 선생님 셀룰러 신호8,9 및 면역 응답10등 다양 한 생물학 과정에서 유익한 역할에 불구 하 고 선생님 생산 및 그것의 해독 사이의 불균형이 발생할 수 있습니다, 산화를 선도 7스트레스. 선생님의 생물 목표 단백질, 지질 및 핵 산의 산화가 그들의 구조와 기능에 영향을 미칠 있습니다. 따라서, 셀룰러 oxidants의 축적은 강하게 pathologies 암9,11, 염증12,13, 노화14, 등의 다양 한 범위에 연결 15, 그리고 발병 및 Alzheimer의, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환의 진행, 그리고 루 게 릭 병 질환16,,1718에 관련 된 발견 되었습니다.

모두 새로 합성 하 고 성숙한 단백질 단백질 구조와 기능19,20모양 그들의 사이드 체인의 잠재적으로 유해한 수정으로 인 산화에 매우 민감합니다. 따라서, 산화 스트레스는 일반적으로 광범위 한 단백질 비활성화, misfolding 및 집계, 결국 세포 죽음으로 이어지는 리드. 광범위 한 단백질 집계 misfolded 클라이언트 단백질21와 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 대신 억제 redox 종속 보호자를 활용 하는 단백질 산화의 잠재적인 손상에 대처 하기 위해 우아한 셀룰러 전략 중 하나 ,,2223. 이 첫 번째-라인 방어 보호자 강력한 안티 집계 분자24로 그들을 변환 하는 (보통에 시스테인 잔류물) 사이트별 산화에 의해 급속 하 게 활성화 됩니다. 산화 스트레스 조건25,26 동안 정식 ATP 의존 보호자는 덜 효과적인 산화 스트레스 결과 호흡 억제 및 세포질 ATP 레벨25감소, 이후 27. 따라서, ATP 독립 보호자 redox 활성화 재생 oxidants 박테리아 및 진핵생물의 축적에 따라 단백질 항상성 유지에 중요 한 역할 (예:Hsp3328 , RidA29 박테리아, Get3에에서30 효 모, peroxiredoxins31 진핵생물에서에서). 이러한 보호자의 활동 강하게 소수 지역 misfolded 클라이언트 단백질의 인식에 관련 된 폭로 사이트 산화에 의해 유도 된 가역 구조 구조적 변화에 따라 달라 집니다.

반대로 집계 메커니즘 및 클라이언트 단백질의 인식 보호자에 의해 통치 원리의 연구 보호자 기판 상호 작용32,33의 역동적이 고 heterogenic 특성상 쉽지 않다 34,35,,3637. 그러나, 스트레스 통제 보호자는 그들의 능력 때문 반대로 집계 함수에 대 한 우리의 이해를 전진 하는 기회: 1)는 보호자, (예를 들면, 산화) 활성 및 비활성 (예를 들어, 두 가지 형태를 얻을 감소), 소개 또는 쉽게 전환 (예:산화 제, 환 원제), 그들 2 스트레스 조건 제거)는 광범위 한 기판, 3) 클라이언트 단백질에 의해 평가 될 수 있는 매우 안정적인 단지 형성 다른 구조적 방법론, 및 4) 기판 인식 및 릴리스, 대부분 이러한 보호자의 접는 기능 부족으로 redox-종속 구조적 변화에 의해 중재에 전적으로 초점을.

여기, 우리 세균 redox 규제 보호자 Hsp33의 안티 집계 활동, 산화 유도 단백질 집계28에 대 한 세균 방어 시스템의 중요 한 구성 요소를 분석합니다. Hsp33는 활동 없이 보호자; 밀접 하 게 접힌된 아연-바인딩 단백질 감소, 그러나, 산화 스트레스에 노출 되 면 Hsp33의 기판 바인딩 지역38,39노출 광범위 한 구조적 변화를 겪 습. 산화, 시 C 터미널 도메인의 4 개의 높은 보존된 시스테인 잔류물에 강력 하 게 바인딩된 아연 이온 출시40입니다. 이 결과 C 터미널 도메인 및 인접 한 링커 지역41의 불안의 전개는 두 개의 이황화 결합의 대형에. C-터미널, 링커가 지역은 매우 유연 하며 본질적으로 또는 부분적으로 무질서로 정의 됩니다. 아닌 스트레스 조건에 반환, 시는 시스테인 감소 되 고는 보호자 안티 집계 활동 없이 네이티브 접힌된 상태로 돌아갑니다. 보호자의 refolding 더 전개를 지도 하 고 바인딩된 클라이언트 단백질 트리거 refolding38정식 보호자 시스템, DnaK/J, 그것의 이동의 불안정. Hsp33의 상호 작용 사이트의 분석 제안 Hsp33 사용 하 여 두의 충전 무질서 잡으려고 링커 N 맨끝 도메인에 소수 성 영역 뿐만 아니라 영역 클라이언트 단백질을 misfolded 고 방지 그들의 집계38, 42. 접힌된 상태에서이 지역 접힌된 링커 및 C 터미널 도메인으로 숨겨져 있습니다. 흥미롭게도, 링커 지역 "감지" 그것의 인접 한 C 터미널 도메인34의 접는 상태 Hsp33의 접힌된 비활성 상태의 게이트 키퍼 역할을 합니다. (포인트 돌연변이 또는 전체 순서 섭 동에 의해 중) mutagenesis에 의해 불안정 하 게, 일단 그것의 산화 환 원에 민감한 시스테인43의 산화 환 원 상태 Hsp33 constitutively 활성 보호자 관계 없이로 변환 됩니다.

여기에 제시 된 프로토콜 활성화 시 매핑은 구조적 변화 뿐만 아니라 Hsp33의 redox 종속 보호자 활동 모니터링 클라이언트 단백질의 바인딩을 허용 합니다. 이 방법론은 다른 보호자 클라이언트 인식 모델 뿐만 아니라 비 보호자 단백질-단백질 상호 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 단백질 활동에 단백질 산화의 잠재적인 역할을 다른 산화 환 원 스위치 단백질의 연구에 사용할 수 있는 완벽 하 게 감소 하 고 산화 보호자의 준비에 대 한 프로토콜을 제시.

우리가 보호자 활동에서 생체 외에서 모니터링 하 고 다른 유형의 단백질 집계 (화학적 또는 열 유도) 산란 (LS)에 의해 측정을 사용 하 여에서 그것의 기질 특이성을 정의 하는 절차를 설명 하는 구체적으로 fluorospectrometer44. 집계, 동안 360 nm 증가 급속 하 게 증가 탁 때문에 분산을 빛. 따라서,이 파장에서 시간에 따른 방식으로 집계를 모니터링할 수 있습니다. LS는 단백질 집계 및 따라서 nanomolar 농도, 활성화 단백질 집계 관련 운동 매개 변수에서 다른 특성을 사용 하 여 관심사의 단백질의 안티 집계 작업 테스트를 위한 신속 하 고 민감한 방법 조건입니다. 또한, 여기에 설명 된 LS 프로토콜 비싼 장비를 요구 하지 않는다 그리고 어떤 실험실에 쉽게 설치 될 수 있다.

그럼에도 불구 하 고, 그것은 "깨끗 한" 운동 곡선을 얻을 수와 같은 빛을 뿌리는 실험, 소음 및 공기 방울 및 큰 집계에 의해 생성 된 outliers의 많은 수에서 단백질의 운동 매개 변수를 파생 하는 매우 도전. 이 장애물을 극복 하기 위해 소설 그래픽 도구, Kfits45, 다른 운동 측정, 특히 단백질 집계 운동 데이터에 대 한 장착에 잡음 레벨을 감소 시키기를 위해 사용 하는 것이 선물이. 이 소프트웨어는 결과의 초기 평가 대 한 예비 운동 매개 변수를 제공 하 고 "깨끗 한" 많은 양의 데이터 신속 하 게 운동 속성을 영향을 주지 않고 사용자 수 있습니다. Kfits 파이썬에서 구현 이며 45오픈 소스에서 사용할 수 있습니다.

필드에 도전적인 질문 중 하나는 보호자와 그들의 클라이언트 단백질 사이 상호 작용 사이트를 매핑 및 보호자 misfolded 기판의 넓은 범위를 인식 하는 방법을 이해 관련이 있습니다. 이 질문은 더 복잡 보호자 및 집계 경향이 기판 무질서 공부 본질적으로 포함 하는 매우 동적인 단백질 복합물. 다행히도, 구조 질량 분석은 극적으로 지난 10 년간 고급 고가 성공적으로 도움이 접근 및 구조상가 소성을 분석 하 고 잔류물 단백질 인식46, 에 지도 하는 도구 47 , 48 , 49. 여기, 선물이 하나 이러한 기술은 수소 중수소 교환 질량 분석 (HDX-MS)-단백질 수정 또는 단백질/Ligand 바인딩35, 구조 형태에 잔류물 수준 변경의 매핑 수 있습니다 50,51,,5253,54,55. HDX MS 중수소, 화학 환경, 접근성, 속도의 영향을 받는 여 백본 hydrogens의 지속적인 교류를 사용 및 공유 및 공유 결합56. HDX MS deuterated 용 매, 일반적으로 중 수 (D2O)를 사용 하 여 이러한 exchange 프로세스를 추적 하 고 측정 수소 중수소 교환에 따라 분자량의 변화에 따라 수 있습니다. 수소 중수소 교환 속도가 느리거나 hydrogens 수소 결합에 참여 또는, 간단 하 게, 구조57에서 로컬 변경 사항을 나타내는 입체 방해에서에서 발생할 수 있습니다. Ligand 바인딩 또는 포스트 번역 상 수정 변경 수소 중수소 교환 (HDX) 요금46,53에 차이에 결과 바인딩을 사용 하 여 수소 환경에 차이 또한 발생할 수 있습니다.

우리는 급속 하 게 산화, Hsp33의 활성화로 이어지는 시 전개 2) 그것의 전체 길이 misfolded 기판, 구 연산 염 synthase (CS)38와 Hsp33의 잠재적인 바인딩 인터페이스 정의 1) 지도 Hsp33 지역에이 기술을 적용.

이 원고에 설명 된 방법은 redox 종속 기능 단백질에 체 외에, 안티 집계 활동 및 정의 구조 변경의 역할 (있을 경우) 단백질 기능 연구에 적용할 수 있습니다. 이러한 방법론을 쉽게 다양 한 생물 학적 시스템에 적응 하 고 실험실에서 적용 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 완벽 하 게 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비

  1. 완벽 하 게 감소 된 단백질의 준비
    참고: 여기, 우리가 설명 아연 포함 된 단백질 및 단백질 Zn 통합, 감소 된 상태를 복원할 ZnCl2 를 사용 하 여 솔루션의 감소. ZnCl2 솔루션 대체 하거나 삭제 될 수 있습니다. Note 시간과 온도 감소 과정의 단백질 안정성과 기능에 따라 달라 집니다 및 특정 단백질 당 이렇게 이다.
    1. 얼음에 단백질 견본을 해 동 하 고 제거 집계 아래로 회전. 5mm DTT와 37 ° C와 20 µ M ZnCl2 에서 적어도 1.5 h에 대 한 샘플을 품 어 (단백질 농도의 최대 70%).
      참고:이 단계에서 온도 단백질 및 단백질 안정성에 조정 되어야 한다.
    2. DTT 염 열을 사용 하 여 제거 합니다.
      참고: 다른 담 열을 사용할 수 있습니다. 프로토콜 아래 특정 염 열 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 프로시저를 설명 합니다. 다른 염 열을 사용 하기 전에 일부 염 열 부분적으로 관심사의 단백질을 흡수 수 있습니다 이후 DTT 제거 및 단백질 복구의 그들의 효율성을 검토 하는 것이 좋습니다.
      1. 해당 버퍼와 함께 열을 완전히 채워 고 개 드립 하는 버퍼에 의해 칼륨 인산 (KPi) 버퍼 (40 m m, pH 7.5)로 열을 equilibrate. 2이이 과정을 반복 하 여 x.
      2. 부드럽게 족집게로 그것을 아래로 밀어 하;을 제거 하 여 열에 백색 디스크 필터 제거 동안 열에 채워집니다 KPi 버퍼를 제거 하는 것이 쉽습니다. KPi 버퍼 열을 리필 하 고 3 분 1000 x g에서 원심.
      3. 깨끗 한 튜브로 열 전송 열의 중간에 천천히 단백질 샘플을 추가 하 고 2 분 1000 x g에서 원심. DTT 무료 단백질 통해 흐름에 지금 있다.
    3. 그것의 농도 확인 (예를 들어, UV/Vis 분 광 계를 사용 하 여) 280에서의 흡 광도 측정 하 고 nm. 맥주의 법률을 사용 하 여 단백질 농도 계산 합니다.
    4. Aliquots에는 단백질의 절반을 배포 합니다. 20 분 산소의 완전 한 제거를 위한 혐 기성 조건 (예를 들어, 혐 기성 챔버를 사용 하 여)에서 aliquots를 품 어. 플라스틱 필름으로 튜브를 봉인 하 고-20 ° C 또는-80 ° C, 단백질에 따라 샘플을 저장 합니다.
      참고: 혐 기성 챔버를 사용 하 여 대신 튜브 수 또한 될 번쩍이 아르곤 가스를 산소를 제거.
  2. 완벽 하 게 산화 단백질의 준비
    참고:이 좋습니다 완벽 하 게 감소 된 단백질 (앞서 설명한)에서 산화 단백질 샘플 준비 하. 이 시스테인의 산화 상태에서이 질을 줄일 것입니다. 그것은 다른 산화 시 약;를 사용 하 여 여기, 우리는 과산화 수소 (H2O2)에 집중 하 고 있다.
    주의: 이상의 산화를 바람직하지 않는 intramolecular 이황화 채권과 시스테인, 메티오닌, 티로신, 등을 포함 한 다른 아미노산의 돌이킬 수 없는 산화를 피하십시오.
    1. 나머지 단백질 샘플 5 m m H2O2 (갓 희석)를 추가 하 고 동요 하는 동안 40 ° C에서 3 시간 그것을 품 어.
      참고:이 단계에서 온도 단백질 및 단백질 안정성에 조정 되어야 한다.
    2. 해당 버퍼와 함께 열을 완전히 채워 고 개 드립 하는 버퍼에 의해 KPi 버퍼 (40 m m, pH 7.5)로 열을 equilibrate. 2이이 과정을 반복 하 여 x.
    3. 부드럽게 족집게로 그것을 아래로 밀어 하;을 제거 하 여 열에 백색 디스크 필터 제거 동안 열에 채워집니다 KPi 버퍼를 제거 하는 것이 쉽습니다.
    4. KPi 버퍼 열을 리필 하 고 3 분 1000 x g에서 원심.
    5. 깨끗 한 튜브로 열을 전송 열의 중간에 천천히 산화 단백질 견본을 추가 하 고 2 분;에 대 한 1000 x g에서 원심 산화 단백질 통해 흐름에 지금 있다.
    6. 1.2.5, 단계에서 단백질 농도 산화 단백질으로 aliquots, 분열과-20 ° C 또는-80 ° C, 단백질-의존에서 그들을 저장 확인 하십시오.

2입니다. 빛 집계 분석 결과 비 산

참고:이 분석 결과에 모든 농도 보호자 및 기판 관련, 고 보정 해야 합니다. 모든 버퍼 버퍼는 어떤 입자의 무료 또는 기포와 큐 벳은 깨끗 하 고 먼지가 매우 중요 0.22 μ m 필터링 되어야 합니다. 석 영 cuvette에 교 반기를 사용 하 여 매우 중요 하다. 다른 활동가 크기와 모양이 바람직하지 않은 기포를 생성 하지 않고 전체 솔루션의 한 효율적인 혼합 수 있도록 확인 하십시오. 또한, 있다 다른 flouorospectrometers 사용할 수 있는 실험실과 시설에서. 여기, 특정 fluorospectrometer는 사용 되었다 ( 재료의 표참조). 다른 악기는 다양 한 감도, 측정 속도, 및 샘플러 매개 변수가 있습니다. 따라서, 정확한 측정 매개 변수 (예를 들어, 방출 및 여기 대역폭, 감도, 및 다른 사람) 알려진된 집계 하기 쉬운 단백질 및 그 해당 조건 사용 하 여 최적화 되어야 합니다. 구 연산 염 synthase (CS) luciferase nanomolar 농도에서 초기 기판으로 이용 하는 것이 좋습니다.

  1. 화학 집계 분석 결과
    1. 잠복기 12 µ M CS 하룻밤에 40 mM HEPES (pH 7.5)으로 변성된 기판 준비 및 4.5 M GdnCl. PH를 유지 하기 위해 GdnCl 40 mM HEPES (pH 7.5)에서 해산.
    2. Fluorospectrometer 소프트웨어를 열고 시간 과정 측정로 이동 합니다. 매개 변수 설정: 온도: 25 ° C; Λem: 360; Em 대역폭: 5 nm; Λ예: 360; 대역폭 ex: 2.5 nm; 데이터 간격: 0.5 s.
    3. 석 영 cuvette에 40 mm HEPES 1600 µ L을 추가 하 여 샘플을 준비 합니다. 샘플 홀더에는 베트를 삽입 하 고 원하는 온도 도달 하는 샘플을 보자.
    4. 감동 600 rpm을 설정 하 고 초기 계획 설정 될 때까지 측정을 시작. 전체 측정는 교 반 계속.
    5. 120에서 보호자의 부재에서 CS 집계를 측정 하기 위해 측정에 s 추가 (부드럽게, 그러나 신속 하 게) 변성된 CS의 10 µ L (75의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s.
    6. 60 Hsp33, 존재 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s Hsp33 추가 (300의 최종 농도 nM). 후 추가 60 s, 변성된 CS의 10 µ L 추가 (75의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s.
      참고: 추가할 때 기판 또는 보호자, 거품의 삽입을 방지 하기 위해, 10 µ L 피 펫을 사용 합니다.
  2. 열 집계 분석 결과
    참고: 열 집계 분석 결과 대 한 온도 그리고 단백질 안정성에 따라 조정 되어야 한다 하지 각 단백질에 독립적으로.
    1. Fluorospectrometer 소프트웨어를 열고 시간 과정 측정로 이동 합니다. 매개 변수를 다음과 같이 설정: 온도: 43 ° C; Λem: 360; 방출 대역폭: 5 nm; Λ예: 360; 여기 대역폭: 2.5 nm; 데이터 간격: 0.5 s.
    2. 석 영 cuvette에 미리 따뜻하게 40 mm HEPES 1600 µ L을 추가 하 여 샘플을 준비 합니다. 샘플 홀더는 베트를 삽입 하 고 샘플 43 ° c.에 도달 하 게
    3. 감동 600 rpm을 설정 하 고 초기 계획 설정 될 때까지 측정을 시작. 전체 측정는 교 반 계속.
    4. 120에서 보호자의 부재에서 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s는 부드럽게 CS 추가 (125의 최종 농도 nM) 1200에 대 한 측정을 계속 하 고 s.
    5. 60 Hsp33, 존재 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s Hsp33 추가 (600의 최종 농도 nM). 후 추가 60 s, CS 추가 (125의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s.
      참고: 추가할 때 기판 또는 보호자, 거품 삽입을 하지 마십시오.
  3. Kfits 데이터 분석 및 잡음 제거
    참고: Kfits 에서 사용할 수 를 사용 하 여 Kfits 의 이전에서 설명 하고있다 Rimon 외. 45
    1. 데이터 파일을 업로드.
      참고: 입력 텍스트 쉼표 구분 또는 탭 구분 형식으로 산란 측정에서 원시 결과 이다.
    2. 모든 소음을 제거 하려면 분석 매개 변수를 선택 합니다. 자동 최고의 모델 을 사용 (권장), 잡음은 항상 신호 플래그를 표시 합니다.
    3. 명백한 outliers 녹색과 빨간색 조절 라인;를 사용 하 여 수동으로 제거 이 단계는 녹색 선 위와 아래 빨간색 선 잡음을 필터링 합니다.
    4. 기준선과 맞는 곡선을 설정 합니다. 노이즈 임계값을 적용 한 후 처리 된 데이터를 다운로드 합니다.

3. 수소 중수소 교환 질량 분석

  1. 버퍼 및 단백질 샘플 (Hsp33 및 Hsp33 CS 복잡 한)의 준비
    1. 25mm Tris HCl 버퍼 pH 7.5에에서 1 mg/mL의 최종 농도에 단백질 샘플을 희석 하 고 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.
    2. 43 ° c.에 1:1.5의 비율로 CS와 Hsp33를 배양 하 여 단백질 기질 복잡 한 샘플을 준비
      1. 어떤 빠른 집계를 피하기 위해 하는 Hsp33와 열 펼친된 CS 간의 유익한 바인딩을 단계별 방식에서 CS를 추가 합니다.
      2. 적어도 4 개의 단계를 사용 하 여 (즉, 최종 볼륨의 4 분의 1을 추가 하는 각 시간) 및 Hsp33에 의해 CS 보호 수 있도록 모든 추가 후 15 분에 대 한 샘플을 품 어.
    3. 모든 집계에서 4 ° c.에서 16000 x g 30 분 원심 분리를 사용 하 여 제거
      참고: 새로운 단백질 기질 단지 준비 되어야 한다 신선한. 기판 또한 점차; 여야 한다 그렇지 않으면, 집계 발생 합니다. 온도, 기판, 및 기질 농도 단백질 다릅니다.
    4. H (25mm Tris HCl, pH 7.5), deuteration 제어 역할, 버퍼와 버퍼 D (25mm Tris DCl, pH 7.09)는 deuteration 버퍼를 준비 합니다. 또한 신선한 냉각 버퍼 (150 m m 3 M GdnCl, TCEP 0.1% 포 름 산)을 준비 합니다.
      참고: 냉각 버퍼 최적화 되어야 합니다 관심사의 단백질을 위해 펩 신 소화 후 최대한 시퀀스 범위를 얻기 위하여.
    5. 튜브로 모든 버퍼 및 샘플을 전송 및 적절 한 쟁반에 넣어. 저장할 버퍼 H와 D 25 ° c (트레이 25 ° C); 다른 한편으로, 0-2 ° C (0 ° C 트레이)에서 샘플 및 냉각 버퍼를 개최. 150 µ L 유리 삽입에 샘플을 배치 ( 재료의 표참조) 먼저, 다음 튜브에 그들을 전송.
  2. 악기의 준비
    참고: 질량 분석기 소프트웨어 프로그램을 동반 2와 함께 제공: 하나 펌프, 제어와 다른 제어 질량 분석기 ( 테이블의 자료를 참조). 이 두 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.
    1. 수동으로 모든 냉각 장치를 켭니다. 모든 냉각 시스템의 목표 온도 도달, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로드 펌프에 수동으로 전환 합니다.
      참고: 우리의 경우,이 2 개의 냉각 목욕 및 냉각 상자 (이 트랩 및 분석 열 포함)의 구성 됩니다. 한 냉각 장치 냉각 0 ° C에서 트레이 다른 25 ° C에서 트레이 유지 하면서 냉각 상자의 온도 1-2 ° C 이다.
    2. 오픈 모두 펌프를 제어 하는 소프트웨어 뿐만 아니라 소프트웨어를 제어 하는 질량 분석기; MS는 대기에 다는 것을 확인 하십시오.
    3. MS 소스에서 HPLC 출구 밸브를 분리 및 세척 시스템 (1% 포 름 산, 33% 이기, 소 프로 파 놀 33%, 33% 메탄올), "트리플 청소기" 솔루션으로 먼저 다음 버퍼 B (80% 이기, 0.1% 개미 산 성), 그리고 마지막으로와 버퍼 (0.1% 개미의 산 성, pH 2 월 25 일), 펩 신 열 시스템에 삽입. 버퍼를 변경 하는 경우 계속 하기 전에 두 펌프를 제거 해야 합니다.
    4. 두 펌프의 유량 0.1 mL/min 이며 압력은 안정 되어 있는 확인 하십시오.
    5. 씻은 후 꾸준한 흐름 및 꾸준한 압력 시스템, MS 소스에 HPLC 콘센트를 삽입 하 고 MS를 켭니다.
  3. 질량 분석기 매개 변수
    1. 175 ° C, 17, 2, 보조 가스 발광 및 4.5에서 스프레이 전압 칼 집 가스 흐름에서 분무 이온화 (ESI)에 펩 티 드 이온화 설정 kV (보충 그림 1).
    2. 다음과 같이 비 deuterated 샘플에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 매개 변수 설정: 스캔 범위 m/z 300-1500; 해상도를 70000; 자동 이득 제어 대상 (AGC) 106; 그리고 100 ms에 (그것은) 최대 주입 시간.
        참고: + 2와 + 6 사이 충전 상태와 5 가장 강렬한 이온 (1.3 x 10 보다 더 높은 그들의 강도4)에 30의 동적 창 격리 됩니다.
      2. 높은 에너지 collisional 분리 (HCD) 정규화 된 충돌 에너지 (후부 터) 28 크거나 여러 충돌 셀에 의해 이온 조각화를 수행 합니다. 탠덤 MS 10의 35000, AGC 대상의 해상도에 의해 조각 이온을 검출5, 최대 60 ms, 그리고 2.0 m/z의 격리 창에서.
    3. Deuterated 샘플에 대 한 MS1 만 140, 000의 높은 해상도 그렇지 않으면 유사한 매개 변수를 사용 합니다.
  4. 실험을 실행
    1. 다음과 같은 방식으로 트레이 설정 합니다.
      1. 트레이 25 ° C, H와 D 버퍼 장소 다음 샘플 및 냉각 버퍼 0 ° C 트레이에 놓습니다.
      2. 장소 X 빈 튜브, 두 용지함에 정렬, 어디 X = x 시간 포인트 수 샘플 수.
        참고: 25 ° C 트레이에 빈 튜브 역할 반응 튜브, 그리고 그들은 튜브를 냉각 될 트레이 0 ° C에서.
      3. 빈 병의 각 포함 빈 유리 삽입; 삭제 및 바꾸기 말했다 실험 사이 삽입 합니다.
        참고: 가장 효율적이 고 최소 시간이 걸리는 방법, 샘플을 동시에 실행할 수 있는 소프트웨어에서에서 HDX 실험을 실행 하려면 (보충 그림 2) 사용 되었다. 이 소프트웨어를 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.
    2. 소프트웨어를 엽니다. 다음을 수행 하는 프로그램 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 선택 하는 시간 포인트에 따라 몇 분 동안 버퍼 D의 45 µ L를 각 샘플 (5 µ L)를 품 어 (예, 1, 3, 18, 40, 및 100 분) 25 ° c.에 대신 버퍼 H의 45 µ L와 비 deuterated 샘플을 품 어.
      2. 부 화 후 즉시 차가운 냉각 버퍼의 50 µ L에 deuterated 단백질의 50 µ L를 혼합 하 고 고정된 펩 신 열 (직경에서 2.0 m m, 길이 20 m m)에 그들을 투입 합니다.
      3. 50의 속도로 6 분에 대 한 버퍼 A와 그것을 세척 하 여 펩 신 열에서 모든 펩 티 드를 전 열에 elute µ L/분 계속 버퍼 A에 0 ° c.에 냉각 상자
      4. C18 분석 열으로 전 열에서 펩 티 드 elute (C18 열, 130 Å, 1.7 µ m, 2.1 m m x 50 m m, 0 ° C에서 보관) 이기 그라데이션 버퍼 B 100% 이기를 사용 하 여 100 µ L/분 실행에 이기의 선형 그라디언트를 적용 하 여 그들을 분리 하 고 : 2%, 10-30%, 30-90%, 90%, 90-8%, 1 분 동안 빠른 그라데이션에 1.5 분에서 2.5 분에서 7 분 7 분 및 마지막으로 2%에서 4 분에 대 한 열을 equilibrate.
    3. 빌드 실행 시퀀스 (보충 그림 2참조): 모든 시간 포인트, 샘플 및 쟁반, 버퍼 이름에 있는 위치 이름과 위치를 입력 하십시오.
      참고: 소프트웨어는 실행 시간을 감소 하는 한 번에, 효율적으로 하는 여러 샘플을 실행 하는 프로그램으로 모든 다른 실행 시간의 맞춤 수 있습니다.
  5. 데이터 분석
    참고: 협력 펩 티 드 식별 및 HDX 워크 벤치, 시퀀스 범위의 분석에 대 한 프로테옴 발견자 와 MaxQuant (무료 소프트웨어)를 포함 한 데이터 분석 과정에서 여러 가지 소프트웨어 프로그램을 단백질, 중수소 결합의 분석 및 실험의 다른 세트 사이 HDX 속도의 비교를 허용 하는 무료 소프트웨어. 이러한 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.
    1. 소프트웨어 (보충 그림 3)를 통해 비 deuterated 제어 샘플을 실행 하 여 샘플의 펩 티 드 범위를 분석 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 소프트웨어를 설정 합니다.
      1. (불특정) 아니 효소 Sequest HT 메서드를 사용 하 여 다니엘. 7 ppm 및 선구자의 이온 및 조각에 대 한 0.5 다의 대량 허용 오차 4-144 아미노산의 펩 티 드에 대 한 검색. 동적 메티오닌 산화에 대 한 허용.
      2. 단백질,이 통해 소프트웨어 펩 티 드 범위를 확인할 수 있습니다에 대 한 데이터베이스를 만듭니다. 텍스트 형식으로 확인 된 펩 티 드를 내보냅니다.
    2. HDX 워크 벤치 무료 소프트웨어58을 사용 하 여 deuterated 결과 분석 합니다.
      1. 단백질 편집기 열고 단백질 시퀀스 및 펩 티 드 적용 파일을 삽입 하 여 단백질을 정의 합니다.
      2. 다음, 설치 마법사 실험 편집기를 열고 요청 하는 모든 입력을 입력 합니다.
        참고: 샘플 수, 시간 포인트 수, 복제 수, 버퍼, 그리고 온도 pH 값, 프로그램 필요합니다.
      3. 마지막으로, 질량 분석기, 사용 후 프로그램 검색 된 펩 티 드의 목록이 생성 관련 매개 변수를 입력 합니다.
        참고: 소프트웨어 "HDX" 펩 티 드를 감지, 동위 원소 클러스터를 검사 하 고 샘플에서 deuteration의 명확한 시각화를 보여 줍니다.
  6. 데이터 프레 젠 테이 션
    1. PyMol 소프트웨어 또는 다른 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 구조체에 경의 표 deuteration 통풍 관으로 영역을 레이블을 지정 합니다.
    2. B 요소 값 대신 중수소 이해 수준을 소개 합니다.
      참고: 기본 자습서 https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners에서 찾을 수 있습니다.

결과

제시 하는 두 가지 방법 운동 활동과 보호자와의 기판 간의 단백질 상호 작용의 역동성에 따라 가능 하 게. 또한, 감소-산화 프로토콜 redox 의존 무질서 보호자의 활성화 메커니즘의 더 심도 있는 이해를 주는 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 보호자의 준비를 수 있습니다.

첫째, 우리는 보호자의 redox 종속 활동 검사 산란 사?...

토론

이 문서에서 우리는 redox 종속 보호자 활동의 분석 및 클라이언트 단백질의 바인딩 따라 구조 변화의 특성에 대 한 프로토콜 제공. 이들은 잠재적인 보호자 기판 단지 정의 하 고 잠재적인 상호 작용 사이트 분석을 보완 방법론입니다.

여기, 우리는 잘 공부 보호자 기판 CS와 redox 규제 보호자 Hsp33 사이 복잡 한 특성에 대 한 이러한 프로토콜을 적용. 우리는 두 가지 유형의 단백?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 그녀의 도움이 토론에 대 한 Meytal Radzinski에 게 감사 하 고 HDX 분석 플랫폼을 설정 하는 동안 그들의 무제한 지원에 대 한 문서, 그리고 패트릭 그리핀와 그의 실험실 멤버를 읽고 중요 한 있습니다. 저자는 독일-이스라엘 재단 (나-2332-1149.9/2012), Binational 과학 재단 (2015056), 마리 퀴리 통합 그랜트 (618806), 이스라엘 과학 재단 감사 (1765/13 고 2629/16), 그리고 인간 프론티어 과학 그들의 재정 지원 프로그램 (CDA00064/2014).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plusSigma Aldrich34998-2.5Lsolvent
Formic acid Optima LC/MSFisher ChemicalsA117-50solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC gradeFisher ChemicalsP750717solvent
MethanolFisher ChemicalsA456-212solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma Aldrich252859buffer
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich76-05-1solvent
Water for HPLCSigma Aldrich270733-2.5L-Msolvent
ZnCl2, Zinc ChlorideMerckB0755416 308reagent
DTTgoldbio27565-41-9reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcareGE healthcare29-9180-07desalting column
Potassium PhosphateUnited states Biochemical Corporation20274buffer
Hydrogen peroxide 30%MerckK46809910526oxidizing agent
citrate synthasesigma aldrichC3260substrate
HEPES acid freesigma aldrich7365-45-9buffer
Gndclsigma aldrichG3272-500Gdenaturant
Deuterium Chloride Solutionsigma aldrich543047-10Gbuffer
Deuterium Oxide 99%sigma aldrich151882-100Gsolvent
TCEPbioworld42000058-2reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvetteHellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 FluorospectrometerJasco
Thermomixer ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifugeThermo Scientific
pH meter , PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm)Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock doorCOY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometerThermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samplesPAL systemhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pumpThermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pumpThermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Datahttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur softwarehttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau)http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 softwarehttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench softwarehttp://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

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