إدارة مختبر بعد: تشخيص الفيروس التنفسي

Summary

مختبر للانتشار السريع، وخارج الشبكة تم تصميمها وبناؤها للإعدادات العمومية البعيدة، ذات الموارد المحدودة. يتم استكشاف الميزات والجوانب الحرجة من وحدات المختبر لوجستيا محسنة، وقابلة للتوسيع، ومتعددة الوظائف. وضع قائمة مرجعية لسير عمل مختبرات أساسية ووضع بروتوكول لاختبار تشخيص فيروسية تنفسية وقدم.

Abstract

Uptick في الأخيرة الأوبئة (الإيبولا، زكى، أسعار الصرف السوقية، الإنفلونزا، إلخ) يؤكد الحاجة مزيد 'ذكيا،' تنسيق الاستجابة التي تتناول العديد من القضايا التي تتراوح بين النقل والوصول، المرافق، المعدات، والاتصال بموفر التدريب. ولتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير مرفق مختبر مبتكرة، قابلة للتطوير، والمزودة بالخدمات اللوجستية، المتنقلة، لحالات الطوارئ والأوبئة في إعدادات عمومية ذات الموارد المحدودة. استخدام خلفية في العمليات السريرية كمركز أكاديمية طبية، صممنا على الانتشار السريع، ووحدات BSL-2 و BSL-3 مرفق مع البرمجيات سهلة الاستخدام لتتبع وإدارة الأدوية والإمدادات في المناطق النائية خلال الأوبئة و حالات التفشي. نقدم هنا، لدينا وحدات المختبر حاوية الشحن المتعدد الوسائط، ومتحركة، وقابلة للتوسيع. ويسهل تصميم المختبر الاستخدام خارج الشبكة بالتقليل من استهلاك الطاقة، والسماح لمصادر المياه البديلة. المعلومات الوحدة منصة لتكنولوجيا الاتصالات ويوفر الوثائق (ط) سهلة الاستخدام المستندة إلى الكمبيوتر اللوحي، (ثانيا) تعزيز تتبع للمرضى، واللوازم، و (ثالثا) إدماج الاتصالات في الموقع مع قدرات مضمنة الرعاية الصحية عن بعد. لضمان الجودة في بيئات نائية، قمنا بتطوير قائمة مرجعية لسير عمل مختبرات أساسية ووضع بروتوكول لتشخيص الفيروسية التنفسية باستخدام النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR). كما هو موضح، يسمح هذا النهج المبتكرة والشاملة لتوفير قدرات المختبرات في بيئات عالمية ذات الموارد المحدودة.

Introduction

التشخيص السريع أداة بالغة الأهمية في مكافحة العدوى الفيروسية في الوقت المناسب، لا سيما إذا كانت الأعراض المبكرة يمكن تمييزها لمجموعة متنوعة من الأمراض المعدية. تفشي فيروس إيبولا مؤخرا (2014-2015) في غرب أفريقيا^1،2، أوبئة فيروس Zika (2015-2016) في آسيا وأمريكا اللاتينية^43،، وظهور الفيروس التاجي المتلازمة التنفسية الشرق الأوسط (الصرف) التهابات^5،6، والأوبئة الفتاكة غير عادي الإنفلونزا (الإنفلونزا) (2017-2018) في^7،الولايات المتحدة⁸ كشفت الحاجة إلى مرافق المختبرات السريعة-الانتشار، التي تتناول العديد من القضايا من وسائل النقل، والوصول، ومرافق ومعدات، والاتصالات.

القدرة خارج الشبكة (سلطة الحكم الذاتي، وإمدادات المياه، إلخ) أمر حاسم في إعدادات عمومية من المناطق الريفية، والمحدودة الموارد^9،،من¹⁰¹¹. أن تجربتنا في العمليات السريرية، والبرامج العالمية في "كلية طب بايلور" استخدمت لتصميم وبناء مختبر متنقل المستندة إلى الحاوية مع قدرات للنشر سهلة الإعداد والاستخدام المتعدد الوظائف (BSL-2 و BSL-3). صور لهذا المرفق مختبر تنوعاً، وعزز لوجستيا يرد في الشكل 1.

هذا--الانتشار السريع، يحتوي مرفق مختبر تصميم قابلة لتوسيع مماثلة إلى العيادة حاوية تم وصفه مسبقاً ('"جراب الطوارئ الذكية"')^12،13،14، وضعتها "كلية بايلور للطب" و تحت رعاية الوكالة الأمريكية للتنمية. وحدة وجبات واحدة (في وضع النقل) بإبعاد 9 أقدام 9 بوصات × 8 متر × 8 أقدام (الشكل 1 أ، ب)، ويوسع على مساحة 170 متر مربع (15.75 م²) (الشكل 1، د). يمكن نشر الوحدة من اثنين إلى أربعة أشخاص في أقل من عشر دقائق.

بنيت المختبر البعيد لإنشاء مرفق مختبر BSL-2 (الشكل 2A) مع منفصلة، وحدات، إلحاقه، BSL-3 وحدة (الشكل 2) مصممة للعمل مع العوامل المعدية التي قد تسبب أمراض خطيرة أو يمكن أن تكون مميتة عن طريق الاستنشاق ¹⁵-تمكن اتصال وحدات المختبر هما الأمثل لسير العمل التجريب، وتقاسم الموارد، وفورات (الشكل 2 ج-ه).

الوحدات النمطية يتم الغلق والمياه محكم لإنشاء ملجأ الطاقة متنقلة كفاءة مريحة،. يتم استخدام التدفئة والتهوية والتكييف (HVAC) نظام الهواء لوحدات مركزية والتحكم في درجة الحرارة. وبصفة عامة، تصميم وحدات المختبر تقلل استهلاك الطاقة باستخدام مصادر الطاقة البديلة الخاصة بهم مثل الألواح الشمسية و/أو مولد كهربائي مستقل. ويشمل كل وحدة بالوعة ومحطة ايوش والطاقة الكهربائية والمياه موصلات (الشكل 3 أ-ج). منهاج تكنولوجيا المعلومات والاتصالات توفر اختيارية، المستندة إلى الكمبيوتر اللوحي (الهاتف/حي الروبوت أو فون/باد) وثائق التطبيق لتتبع العرض ووثائق النتائج المختبرية (الشكل 3D) وضعت في شراكة مع تكنولوجيا المعلومات (IT بايلور) فريق البحث الذي لديه خبرة جيدة في العمل في بيئات نائية مع إمكانية اتصال محدودة. النظام يمكن أن تعمل باستخدام الإشارات الخلوية أو لاسلكية، وتسمح الوثائق دون اتصال، مع النسخ الاحتياطي الفوري أو الإرسال إلى ملقم يستند إلى تأمين سحابة عند إعادة تأسيس الاتصال.

المختبر لديها العديد من الميزات الرئيسية لمكافحة العدوى، بما في ذلك: (أ) ضغط التدفق، (ب) صندوق قفازات أو السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، (ج) إدارة مخاطر صحية نظام الهواء السلبية: مبيد للجراثيم الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية-ج) نظام إضاءة استخدام التسلسلات الهرمية 4 الدفاع ثبت للقضاء على 99.7 في المائة من مسببات الأمراض التي تسبب العدوى المتعلقة بالرعاية الصحية. هو تطهيرها المرفق بسهولة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين أو هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض) نظم لتطهير كفؤة وفعالة. ¹⁶

ضمان جودة النتائج المختبرية يعتمد على التزام بتقييم جميع جوانب عملية اختبار التشخيص الكامل. وهنا، نقدم قائمة مرجعية لسير العمل المختبري BSL-2، و BSL 3، ووضع بروتوكول لاختبار التشخيص السريع فيروس الالتهاب الرئوي. تشخيص الأمراض الفيروسية المقترحة تعتمد على الكشف عن الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الفيروسي في العينة (غسل الآنف، والدم، والبراز، والبول، إلخ) من خلال الوقت الحقيقي عكس النسخ تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR). القدرة على سرعة تقدير الأحمال الفيروسية في عينة يجعل PCR أداة فعالة للأمراض الفيروسية فحص^17،18. تنفيذ الرواية، فحوصات التشخيص الجزيئي يتيح توسيع قدرات التشخيص للفيروسات مثل فيروس إيبولا^19،،من²⁰²¹والإنفلونزا^8،22والدرن (السل )²³.

والهدف من هذا العمل هو للتحقق من صحة منشأة رواية مختبرية معيارية والانتشار السريع وتقديم دليل تدريب لموظفي المختبرات العاملة في بيئات نائية، منخفضة الموارد أثناء وباء أو الكوارث الطبيعية أو غيرها الإغاثة في حالات الطوارئ الحالة. نقدم هنا، بروتوكولا لتشخيص الإنفلونزا الالتهاب الرئوي في هذا المختبر المبتكر، والمحمولة.

Protocol

1-التثبيت

ملاحظة: يلزم فقط 2-4 أشخاص لنشر وحدة مختبر "ليغو--مثل". على النحو الأمثل، ستستخدم الأفراد 4 لنشر، ولكن من الممكن مع 2 فقط.

1. استخدام شاحنة رفع شوكة (الشكل 1 أ،ب) أو أي جهاز رفع مناسبة للتعامل مع الحاوية. استخدام شاحنة رفع شوكة مع مالا يقل عن سبعة أطنان من رفع القدرة على التعامل مع هذين النوعين من الحاويات²⁴.
2. لإنشاء وحدة مختبرات، حدد تصحيحًا لما يقارب 90 × 60 قدما مربعا (27.4 × 18.3 م²) في منظر شقة التأكد من أية عوائق تعوق التخطيط السليم. التأكد من أن الموقع جيدا استنزاف التربة لضمان الصرف موقع كهذا قد يسبب تقع المشاكل المحتملة مع تبديد المياه بعد سقوط الأمطار. استخدام الأسباب التي قد وجهت سابقا والتي هي التربة المضغوطة الثابت لقوة ضاغطة الحد الأدنى من 10 kN/مارك ألماني². ينبغي أن تسمح بالحصول على المعدات اللازمة لتفريغ الوحدة من جهاز نقل المنطقة المحيطة واستيعاب معدات الدعم اللازمة لإنجاز المهمة.
3. ضع وحدة أو وحدات 'أسلوب النقل' في وسط الموقع المحدد وقم بضبط المستوى. كل وحدة مجهز بأربعة مقابس التسوية بالسماح بنشر على موقع يحتوي على درجة الحد أقصى من 6.5% (~ 4 درجات). برفع الحد الأدنى للحاويات ~ 6 بوصات لضمان أن تعمل الكلمة المصارف وأنابيب التصريف بشكل صحيح. لا تشمل الرافعات أكثر من 12 بوصة. إرفاق قوس الدعم لذراع جاك. التأكد من أن الحاوية هو المستوى عن طريق وضع آلة رفع مستوى فقاعة في مركز للسكك الحديدية أسفل كل. لا تقم بتوسيع الوحدة حتى أنه تم وضع بشكل صحيح!
4. قم بتوسيع الوحدة عن طريق فتح اللوحات للأداء الوظيفي الكامل. أولاً قم بتحديد موقع القطب الدعم ملابس. قم بتوصيل القطب الدعم حيث يكون ارتفاعها تقريبا يصل إلى وحدة الحاوية. القطب يسمح للمستخدم بفتح لوحة ودعم وزن لوحة سقف كما فتح الأبواب الجانبية. وهناك مقطع سلامة بمثابة pin للحفاظ على الألواح مؤمناً. قم بإزالة مقطع السلامة أولاً، ثم رفع وسحب دبوس قفل كام من الحفرة. وضع الدبوس خلف الرافعة والخروج من الطريق رافعة قفل كام تقع على جانبي (قابلة للتوسيع) أسفل الحاوية.
5. رفع سقف الدعامات 1 الفريق النظر في أن هذا الفريق قد الغاز ومجرد لوحة الأبواب غير مقفلة، ستطلق سراح الدعامات. هذا سوف يسمح للمستخدم لرفع السقف (الفريق 1) استخدام القطب الدعم ملابس. نقل تلميح إلى القطب الدعم تحت لوحة سقف لدعم مؤقتاً فإنه (الشكل 4 أ).
   1. بينما عقد لوحة السقف مع كزة الدعم، العثور على سلسلة السلامة، تقع في أعلى الجانب الأيسر من الحاوية. مع مساعدة الأفراد 2-3، بعناية اسحب أسفل لوحة 2 حتى سلسلة السلامة على التوالي، عقد وزن الفريق 2 وانخرطت.
   2. قم بتوصيل حزام حزام ونش إلى جبل العروة باليد بالالتفاف من حول الجزء خارجي تبختر الغاز. ملاحظة إذا لم يكن هناك لا أداة ونش، يمكن إكمال الخطوة السابقة يدوياً مع شخصين على الأقل على كل جانب من لوحة عقد يدوياً وخفضه.
      تنبيه: وزن الفريق 260 رطل!
6. ضمان وجود لا أشخاص أو عناصر طريق الفريق 2 واستخدام الرافعة والحفر، والمضي قدما إلى انخفاض الفريق (الشكل 4 باء). عندما يتم تخفيض 2 الفريق تماما، افصل حزام ونش وبكرة مرة أخرى في ونش. إزالة ونش ووضعه على الجانب المعاكس للحاوية في التحضير لاستخدام. كلا الجانبين للوحدة مماثلة واتبع نفس الخطوات أعلاه للجانب الآخر للوحدة.
7. للنشر الكامل للجانب الأول، تصل إلى الفريق (وهو حاليا الكلمة) ومع شخصين على الأقل على كل جانب، يدوياً رفع الفريق 3 إلى الأعلى في مكانها كالباب والجدار الأمامي من الجانب (الشكل 4). سوف تظل الشخصين عقد الفريق 3، بينما الشخص الثالث يزيل القطب الدعم.
   تنبيه: لا أحد ينبغي أن يكون داخل الوحدة أو تحت السقف حتى 3 لوحة الجدار في مكان!
8. من الداخل من الفريق 3، موقع المزالج اثنين وقفل عليها في مكانها باستخدام حزام الأمان. تأكد من أن يتم سحب حشايا المطاط لوحة السقف الأسود الوجه داخل الوحدات. يجب أن يتم هذا لمنع المطر والأخرى تغلغل المياه إلى الوحدة.
   1. من داخل الحاوية، افتح لوحة 4. مرة واحدة مقفلة، طرد الفريق 4 (الشكل 4) حيث أن ذلك يتأرجح مفتوحة مثل باب. سلامة قفل الاثنين المزالج داخل الجدار. افتح لوحة 5 وكرر نفس الخطوات للوحة 4. تأمين هذا الفريق مع نفس السلامة الداخلية المزالج. بمجرد قد تم تأمينه داخل الوحدة بأكملها، إعادة تشديد الحبل حتى الكلمة ومختومة نهاية الجدران.
9. حالما يتم توسيع كلا الجانبين من الحاوية بأمان، تحقق من الرافعات وإجراء أي تعديلات ضرورية من التحول الذي قد يكون قد حدث. تحقق من المأوى أن مستوى أسبوعيا. بعد الطقس المتطرفة (المطر أو الرياح) فحص الرافعات في حاويات وتعدل وفقا لذلك.
10. قم بتوسيع حاوي الثانية إذا كان يزمع وحدات المختبر قابل للاتصال لاستخدام (الشكل 5).
11. الاتصال الوحدات إلى مصدر للطاقة، وإمدادات المياه. يمكن الاطلاع على تعليمات مفصلة عن تركيب مولد الديزل متصلاً بهذه الوحدات من خلال مربع الكسارة في دليل وفقا²⁴.
    ملاحظة: يتم الآن نشر وحدة مختبر بعد. وحدة التخزين غير قابلة للطي الداخلي وحدة يسمح بتخزين الحد الأدنى لتوريد المعدات والمختبرات اللازمة لإجراء اختبارات تشخيصية معينة. ويرد بالتفصيل²⁴ تركيب نظام الضغط لوحدة BSL-3 ويتطلب مراقبة نوعية إضافية. ²⁴

2-قائمة مرجعية للحماية الشخصية، وسير عمل المختبرات الأساسية

ملاحظة: خطأ في أي من السلامة العامة ومختبر التجارب مراحل شرط قد يبطل نتائج عملية الاختبار الكامل.

1. قبل تستعد لدخول وحدة المختبر المثبتة، التأكد من أن جميع متطلبات السلامة BSL-2 أو BSL 3 تحسب: خلع الملابس مع المعدات الواقية السليمة للموظفين (معدات الوقاية الشخصية)، غسل اليدين وارتداء القفازات، وأي مساحات العمل التي يتم تطهيرها لاستخدامها.
2. اتبع هذه القائمة المرجعية في الجدول 1 الذي يحتوي على شروط السلامة للحماية الشخصية أثناء الاختبارات المجراة في المختبر BSL-2 ووحدة BSL-3 (صندوق قفازات المجتمعون الغرف-الضغط السلبي وغرفة PCR-الضغط الإيجابي).
3. تطهير جميع مساحة العمل واللوازم في المختبر. في حالة التخطيط لاستخدام الحل تحت كلوريت الصوديوم (0.5%)، التبييض، ويعرف أيضا باسم السائل لتطهير مساحة العمل واللوازم، وأيضا استخدام الإيثانول 70% لتنظيف جميع المناطق المعرضة للتبييض، كالتبييض يمكن أن تخلط مع المواد الكيميائية الأخرى في مساحة العمل لخلق أبخرة سامة. التصرف في جميع منتجات التبييض إلى بن النفايات المعينة الخاصة بهم.
4. قبل بداية للعمل في وحدة المختبر، أصبحت على دراية بترتيب وتخطيط. تطبيق قواعد صارمة لمعالجة العينات في الغرفة صندوق قفازات (GB). الغرفة غيغابايت من الضغط السلبي! لتشغيل صندوق القفازات، راجع إرشادات الشركة المصنعة. توفر مصادر عدة دروس مفصلة في صندوق قفازات العملية²⁵.
   ملاحظة: الغرض من هذا التحليل هو لاستخراج وتنقية الحمض النووي الريبي (الرنا) أو الحمض الخلوي الصبغي (DNA)، إذا كانت موجودة، من العينات. سيتم اختبار الحمض النووي الريبي/الحمض النووي المستخرج من RT-PCR الوقت الحقيقي للكشف عن وجود أو عدم وجود مسببات الأمراض الفيروسية المستهدفة-الإنفلونزا (INF).

3. تشخيص فيروس الإنفلونزا السريع قبل RT-PCR في منشأة مختبر BSL-2

1. تلقي وتسجيل
   1. تطبيق القائمة المرجعية لمعدات الوقاية الشخصية (انظر القسم 2). INF عامل 2 فئة تتطلب الممارسة BSL-2. معدات الوقاية الشخصية الملائمة للممارسة BSL-2 مطلوب. بالإضافة إلى ذلك، ارتداء نظارات السلامة وطول الأكمام المعاطف مختبر للتقليل من احتمال تعرض الجلد.
   2. ووفقا لتوصيات منظمة الصحة العالمية (WHO)²⁶، استخدام دكرون العقيمة أو مسحات رايون مع مهاوي البلاستيك لأخذ عينات من الجهاز التنفسي.
      ملاحظة: القطن أو مسحات الجينات الكالسيوم، أو مسحات بعصي خشبية وقد تحتوي على مركبات إلغاء تنشيط بعض الفيروسات، وتحول دون بكر اختبار^26،27.
   3. كما يتم أخذ مسحات عينة من المرضى، نقلهم إلى مرفق المختبر من الحقل أو عيادة. نقل عينات من خلال النافذة المار؛ لا يمكن فتح هذه النافذة من كلا الجانبين.
   4. في إطار التمريري، رش أنابيب تحتوي على عينات مع التبييض لمدة 1 دقيقة تليها الإيثانول 70% والقضاء على الجفاف بغية توفير التطهير الكافي قبل أن تدخل وحدة المختبر. بعد غمر، سوف فتح نافذة التمريري فني مختبر داخل الوحدة وجمع العينات من الحاوية التبييض أن تكون مسجلة. عادة، الشخص الذي يمر العينة والشخص استخراج العينة ليست نفسها.
   5. فتح نافذة تمريري وجمع العينات لتسجيلها. مسح أسفل أي من العينات التي تم تطهيرها في بليتش والإيثانول. مسح أسفل داخل الإطار التمريري مع التبييض متبوعاً بمحلول إيثانول 70%. تسجيل عينة داخل النظام التفاعلي القائم على الكمبيوتر اللوحي أو كمبيوتر محمول. تحديد نموذج مع المعلومات التالية:
      --جمع حتى الآن
      -بداية تاريخ
      -المريض العمر والجنس
      -نوع العينة (على سبيل المثال.، مسحه الآنف)
      --المعرفات الفريدة
      -غير ذلك من المعلومات ذات الصلة
   6. استخدام الرموز الشريطية لوسم أنابيب. إضافة رمز شريطي لكل أنبوبة العينة وأربعة أنابيب فارغة المعينة إلى مختبرين. نقل العينات إلى هود تنفيس. مسح رمز شريطي في كل أنبوب وتأكد من أن معلومات تحديد هوية العينة المناسبة يظهر على شاشة النظام أو الكمبيوتر المحمول المستندة إلى الكمبيوتر اللوحي. في حالة عدم توفر الرموز الشريطية، استخدم علامة مقاومة الكحول. دائماً علامة القنينة نفسها، ولم يمكن الحصول على تحول عملية النداءات الموحدة كهذا أثناء التعامل! إكمال عملية التسجيل.
2. عينة قاسمة
   1. وقد صنف أنابيب الاختبار مرة واحدة، استخدام خزانة السلامة الأحيائية 2 فئة معتمد للتعامل مع العينات وجعل مختبرين للعينات. قاسمة واحدة يمكن استخدامها للاختبار الفوري والأخرى المحتفظ بها لغرض الإشارة أو إعادة الاختبار.
   2. كما يصل العينات مع مسحه الآنف تلميح في وسيطة النقل الفيروسي، إثارة نصيحة مسحه في متوسطة لمدة 30 ثانية والضغط عليه ضد الجانب القنينة. ثم إزالته من المتوسطة والتخلص منه مع بروتوكول نفايات اوتوكلاف (على النحو المناسب تجاهل، اﻷوتوكﻻف أو شنق في حل الكلور 1: 100).
      ملاحظة: حجم أصغر من المتوسط التي يجب تخزينها 0.5 مل. وهكذا، يمكن تقسيم عينة 3 مل إلى مختبرين ستة (العينات الفرعية). استخدام أنبوب cryo سعة تخزين 1 مل لكل عينة من 0.5 مل لتوفير الحجم الإضافي للمتوسطة المجمدة.
   3. عندما أخذ مختبرين، استخدام الماصات الطازجة عقيمة أو المتاح لكل عينة وتجاهلها في حاويات النفايات اوتوكلاف تجنبا للتلوث عبر. تأكد من أن كل أنبوب محكم مختومة ومغلقة.
   4. استخدام قاسمة واحد كل عينة لاستخراج فورية وتخزين أي مختبرين الأخرى في الثلاجة (في-80 درجة مئوية كما عينة الجهاز تنفسي) لاستخدامها في المستقبل.
   5. قبل الانتقال إلى محطة العمل، تنظيف جميع الأسطح مساحة العمل والمعدات مع التبييض تليها الحل الإيثانول 70%.
3. استخراج وتنقية
   1. لضمان الجودة لنقل التجارب، المراقب عينة PCR مختبرين من التعامل مع المنطقة إلى محطة العمل (السلامة BSL-2 مجلس الوزراء) مخصص لاستخراج العينات. سلامة هذا مجلس الوزراء يحتوي على مجموعة منفصلة من الماصات للتعامل مع العينة.
   2. استخدام طقم ميني الجيش الملكي النيبالي الفيروسية لاستخراج عينات الحمض النووي الريبي. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتنقية الرنا الفيروسي بروتوكول تدور. إعداد مزيج الرئيسي وفقا لعدد العينات التي تحتاج إلى استخراج. الاحتفاظ بعينه وتحلل مزيج الرئيسي المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة.
   3. إعداد عدد العينات التي تحتاج لاستخراجها. قم بتسمية أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي مل 1.5 مع أرقام الباركود أو المعرف الفريد.
   4. تطبيق مجموعة الماصة إلى 560 ميليلتر. تلميح ماصة نظيفة. إضافة ميليلتر 560 من المخزن المؤقت تحلل لكل أنبوبة المسمى. تجاهل نصيحة. تطبيق تلميح ماصة نظيفة. إضافة ميليلتر 140 من العينة. تجاهل القديمة وتطبيق نصيحة ماصة نظيفة. كرر مع عينة أخرى. تطبيق تلميح ماصة نظيفة. إضافة 140 ميليلتر العازلة لأنبوب المراقبة السلبية. قم بإغلاق كل أنبوب بشكل أمن.
   5. نبض دوامة عينة 1 الكوة مع المخزن المؤقت تحلل لتكرار س. 15 مع نموذج الكوة 2 وأنبوب التحكم. الصغير-الطرد المركزي كل عينة إينكوباتي س. 5 عينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. بعد 10 دقائق من الحضانة، إعادة الطرد المركزي هذه الأنابيب لإزالة أي قطرات من داخل كل غطاء أنبوب. إضافة ميليلتر 560 من الإيثانول الحل بعينه. تغيير تلميح ماصة. كرر مع أي من العينات المتبقية أو إضافية. إغلاق كل أنبوبة العينة بشكل أمن ونبض-دوامة كل عينة للصغير س. 15-الطرد المركزي العينات 5 s.
   7. تطبيق هذا الخليط على عمود الدوران. الحصول على النظيفة 2 مل أنابيب جمع. إضافة أعمدة الدوران، وتسميتها بحيث تتطابق مع العينات. نقل 630 ميكروليتر من عينة إلى العمود المطابق، تبعاً لذلك.
   8. تأمين قبعات والانتقال إلى أجهزة الطرد المركزي. توزيع العينات في أجهزة الطرد المركزي بالتساوي. الطرد المركزي في 6,000 × ز لمدة 1 دقيقة لإزالة المخزن المؤقت تحلل. العودة إلى محطة العمل. استبدال أنابيب جمع. إضافة المخزن المؤقت تحلل المتبقية وكرر الخطوة الطرد المركزي. تجاهل هذه الأنابيب العينة الكوة الأصلي.
   9. التصرف في النذرة وتغسل عمود الدوران مع المخازن المؤقتة اثنين. تطبيق 500 ميليلتر من AW1 المخزن المؤقت. كرر مع كل عينة. تأمين أغطية لكل عينة وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 × ز لمدة 1 دقيقة. كرر مع AW2 المخزن المؤقت الثاني والطرد المركزي في 20,000 × ز لمدة 3 دقائق.
   10. وأخيراً الوت الجيش الملكي النيبالي بإضافة شطف المخزن المؤقت. وضع العمود في أنبوب نظيف 1.5 مل وفتح العمود وإضافة 60 ميليلتر من "المخزن المؤقت لافي احتضانها" في درجة حرارة الغرفة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة. العينات جاهزة الآن لتحليل PCR.
4. [بكر] تضخيم والكشف
   1. أداء [بكر] تضخيم في منطقة منفصلة مخصصة لبكر. الاضطلاع بالتضخيم PCR للهدف الفيروسية باستخدام بروتوكول PCR للإجراء خطوة واحدة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. ملاحظة، مزيج رئيسي باستخدام الفيروسية كبسولة تفجير محددة وتحقيقات، x 2 RT-PCR المخزن المؤقت وإنزيم RT-PCR. إضافة مزيج الرئيسي إلى ألواح أو أنابيب ومن ثم إضافة وخلط العينات الفردية (انظر الفرع 4-4).
   2. نقل اللوحة إلى جهاز PCR وتشغيلها وفقا لظروف التضخيم الهدف الفيروسية. حالما يتم تحميل عينات على الصك PCR يستغرق حوالي 90 دقيقة لإكمال التشغيل.
5. صيانة بعد استخدام المعدات
   1. إجراء الصيانة العادية والدورية بعد استخدام المعدات وفقا الجدول 2.

4. تشخيص فيروس الإنفلونزا السريع قبل RT-PCR في منشأة مختبر BSL-3

ملاحظة: تحت ظروف BSL-3، البروتوكول التجريبي سوف تبقى نفسها، ولكن تدابير السلامة سوف الأسبقية فوق أي شيء آخر. قبل دخول المختبر BSL-3، ننظر من خلال النافذة شفافة ومن المؤكد أن الضغوط السلبية قد أنشئت في وحدة صندوق قفازات. سيكون من الواضح أن الضغوط السلبية قد أنشئت عندما كرة الوردية في جدار مرئية.

1. تلقي وتسجيل
   1. بمجرد الضغط السلبي قد أنشئت، افتح الباب وأدخل الوحدة. فورا غسل اليدين وثم المتابعة مع معدات الوقاية الشخصية. تطبيق القائمة المرجعية لمعدات الوقاية الشخصية، وسير العمل BSL-3 (انظر القسم 2).
   2. المضي قدما لوضع معدات الوقاية الشخصية بالترتيب التالي: تحت القفازات، ثوب، ويغطي الحذاء، قناع، درع الوجه، والزوج الثاني من القفازات. ويوصي بارتداء ثوب كاملة التي تحمي الجسم كله.
   3. قم بتشغيل الجهاز والسماح للضغط في صندوق قفازات لتحقيق الاستقرار. استخدام حل رذاذ التبييض لإزالة التلوث من جميع المناطق واللوازم لاستخدامها داخل وخارج مربع القفازات. التخلص من منتجات النفايات التبييض في وعاء التبييض فقط. وقد استخدمت استخدام الإيثانول 70% الحل لتنظيف قبالة أي مجالات للتبييض.
   4. نقل العينة من خلال النافذة التمريري.
      ملاحظة: قبل السقوط في تمرير من خلال النافذة، تطهير الأنابيب التي تحتوي على عينات من غمر في حمام تحت كلوريت للحد الأدنى 1-2 لا سيما رش العينات بمحلول التبييض وتترك وحدها لمدة 1 دقيقة على الأقل والمار قبل استلامها داخل وحدة BSL-3. الشخص الذي يمر العينة من الخارج والشخص الذي يتلقى، استخراج العينة داخل مختبر BSL-3 يجب أن لا نفسه.
   5. تلقي العينات داخل وحدة BSL-3 وتنظيفها قبل الشروع في تسجيل وتصنيف الخطوات.
   6. تسجيل عينة مع النظام القائم على الكمبيوتر اللوحي التفاعلية أو كمبيوتر محمول. تحديد نموذج مع المعلومات التالية (انظر القسم 3.1.5).
   7. استخدام الرموز الشريطية لوسم أنابيب. في حالة عدم توفر الرموز الشريطية، استخدم علامة مقاومة الكحول.
      ملاحظة: علامة دائماً القنينة نفسها، ولم يمكن الحصول على تحول عملية النداءات الموحدة كهذا أثناء التعامل!
2. عينة قاسمة
   1. بمجرد تسجيل العينات وقد وصفت أنابيب، وضع العينات في صندوق قفازات مصدقة عن طريق علبة مقفلة الهواء لاسترداد العينات المأخوذة من داخل صندوق القفازات. أغلق النافذة. ثم افتح الباب الآخر من خلال صندوق قفازات لاسترداد العينات. لا تفتح الأبواب على حد سواء في وقت واحد. فتح وإغلاق كل باب في اثنين خطوات مختلفة لاحتياطات السلامة. قم بتشغيل الإضاءة البنفسجية.
   2. متى تم نقل العينات بأمان إلى داخل علبة القفازات، اتبع الخطوات المذكورة سابقا لإنشاء مختبرين العينة في علبة القفازات. يمكن استخدام قاسمة واحد من العينة للاختبار الفوري والأخرى المحتفظ بها لغرض الإشارة أو إعادة الاختبار. تصل العينات مع مسحه الآنف تلميح في وسيطة النقل الفيروسي. أخذ العينات ووضع واحدة داخل كل قنينة. يحرك طرف مسحه في متوسطة لمدة 30 ثانية والضغط عليه ضد الجانب القنينة قبل إزالته من المتوسط والتخلص من استخدام بروتوكول نفايات اوتوكلاف (على النحو المناسب تجاهل، اﻷوتوكﻻف أو شنق في حل الكلور 1: 100).
      ملاحظة: حجم أصغر من المتوسط التي يجب تخزينها 0.5 مل، قنينة 1 مل استخدامها لهذا الغرض. وهكذا، يمكن تقسيم عينة 3 مل إلى مختبرين ستة (العينات الفرعية).
   3. استخدام الماصات الطازجة عقيمة أو المتاح لكل عينة والتخلص منها كنفايات اوتوكلاف. وبمجرد عينات الكوتيد، نقل العينات في حاوية محكمة الإغلاق. إغلاق قنينة مع الحماية وإزالة من علبة القفازات.
   4. ضمن المربع القفازات، إغلاق كيس النفايات واقية وإعداد حقيبة نفايات جديدة لتجنب التلوث المتبادل. تطهير مساحة صندوق قفازات العمل تطبيق التبييض لمدة 5 دقائق والحل الإيثانول 70% بعد ذلك.
   5. استخدام قاسمة واحد كل عينة للتحليل الفوري وتخزين البعض الآخر في الثلاجة في-80 درجة مئوية كما عينة الجهاز تنفسي. بعد تطهير الاحتفاظ قاسمة واحد للاختبار، نقل جميع العينات من صندوق قفازات للتخزين في الثلاجة-80 درجة مئوية.
3. استخراج وتنقية
   1. بعد إزالة التلوث، نقل مختبرين عينة المراقب اللازمة لتحليل PCR من العينة التعامل مع المنطقة مرة أخرى إلى مربع القفازات.
   2. في المربع القفازات، تنفيذ كافة الخطوات تحلل لعملية الاستخراج. استخدام طقم ميني الجيش الملكي النيبالي الفيروسية لاستخراج عينات الحمض النووي الريبي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. اتبع الإرشادات خطوة بخطوة لتنقية من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية ببروتوكول تدور في إرشادات الشركة المصنعة.
   3. إعداد عدد العينات التي تحتاج لاستخراجها. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي مايكرو مل 1.5 مع أرقام الباركود أو المعرف الفريد.
   4. إضافة ميليلتر 560 من المخزن المؤقت تحلل إلى 140 ميليلتر من دوامة عينة والنبض. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الإجراء المنظمة يمكن أن تختلف تبعاً لنوع الممرض BSL-3 التي يجري استخراج ومواصلة المنظمة قد يكون ضروريا في بعض الحالات.
   5. بعد خطوة تحلل، أحكام ختم القبعات في كل عينة ووضع في مرور الهواء المضغوط مؤمنة (إذا تم وضع أجهزة الطرد المركزي خارج المربع القفازات). نقل العينات ليسيد إلى مجلس الوزراء لما تبقى الإجراءات السلامة البيولوجية.
      ملاحظة: يمكن إكمال الإجراء الخاص باستخراج وتنقية من الجيش الملكي النيبالي في المربع القفازات أو في صندوق القفازات متبوعاً بمجلس الوزراء السلامة الأحيائية حسب الممرض BSL-3 والبروتوكولات المطلوبة.
   6. تأكد من إزالة التلوث من مساحة العمل واللوازم في المربع القفازات مرة أخرى باستخدام التبييض، والحل الإيثانول 70% لتنظيف جميع المناطق المعرضة سابقا للتبييض.
   7. اتبع الخطوات في القسم 3.3.6-3.3.10 للغسيل والتنقية من الجيش الملكي النيبالي.
   8. بعد استخراج ونقل العينات إلى الإطار تمريري لتحليل PCR.
   9. بعد أن تم إزالة ونقل العينات، تطهير مساحة العمل المختبري خارج مربع القفازات، وفقا للمادة 2.
   10. قبل إزالة معدات الوقاية الشخصية الانتظار حتى وصلت دوران الهواء في الوحدة بأمان إلى العدد الصحيح لتصفية دورات قبل البدء في إزالة معدات الوقاية الشخصية. فورا بعد إزالة والتخلص من جميع معدات الوقاية الشخصية في معدات الوقاية الشخصية حاوية من النفايات، والمضي قدما لغسل اليدين في المختبر بالماء والصابون قبل أن تغادر الوحدة، وفقا للمادة 2.
4. [بكر] تضخيم والكشف
   ملاحظة: يتم التضخيم بكر في منطقة منفصلة مخصصة لبكر والمرتبطة بمنطقة صندوق القفازات عبر نافذة التمريري. يجب أن يتم تطهير قبل اختبار مساحة العمل واللوازم.
   1. إزالة عينات الحمض النووي الريبي المستخرج من إطار التمريري.
   2. أداء [بكر] تضخيم للهدف الفيروسية باستخدام بروتوكول PCR في خطوة واحدة. إعداد مزيج رئيسي استخدام الفيروسية كبسولة تفجير محددة وتحقيقات، x 2 RT-PCR المخزن المؤقت وإنزيم RT-PCR. استخدام أنبوب 1.5 مل مع المكونات التالية لكل مقايسة المستهدفة: المياه، والإشعال والمسابير والمخزن المؤقت x 2 إنزيم RT-PCR. دوامة وتدور مزيج الرئيسي.
   3. قاسمة هذا المزيج الرئيسي في كل من هذه الأنابيب قطاع. عودة طقم PCR للتخزين في درجة الحرارة الموصى بها بمجرد أعد مزيج الرئيسي.
   4. إضافة العينات الفردية لكل من قطاع الأنابيب باستخدام تلميح منفصلة بين كل أنبوبة قطاع. تدور على لوحة عينة أو أنابيب في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. العينات على استعداد ليتم تحميلها على وحدة PCR الوقت الحقيقي.
   5. نقل اللوحة مع عينات للصك بكر وتشغيل الجهاز وفقا لظروف التضخيم الهدف الفيروسية. ويستغرق حوالي 90 دقيقة لإكمال تشغيل واحد.
   6. قبل جمع النتائج وترك المختبر، إزالة معدات الوقاية الشخصية وتطهير كل محطة العمل والتحضير للاختبار التشخيصي المقبل، على نحو كاف وفقا للمادة 2.
5. صيانة بعد استخدام المعدات
   1. إجراء الصيانة العادية والدورية بعد استخدام المعدات وفقا الجدول 2.
      ملاحظة: زمن التشخيص عموما حوالي 4 ساعات. وقت الاستخراج وبكر إعداد الوقت يمكن أن تختلف تبعاً للعدد العينات، والاختبار التشخيصي تستغرق 4-5 ساعات أو أكثر، تبعاً لذلك.

النتائج

والهدف من هذه الدراسة إثبات أن مرافق المختبرات المتنقلة BSL-2، و BSL 3 المقترحة توفر بيئة مناسبة السماح الفيروس التنفسي الاختبارات التشخيصية مع الممثل نتائج مطابقة للاختبارات التي أجريت في عالية الجودة مختبرات ثابتة. مرافق مختبرية مصممة للوفاء بمتطلبات اختبار النظر في توصيات "الصحة المهنية" والسلامة (الصحة والسلامة المهنيتين). أقرب مرفق مختبر البعيد هو المنتشرة (الشكل 4) وجميع المعدات واللوازم مثبتة (الشكل 5)، يمكن تشغيل الاختبارات المعملية.

وفقا للمختبر المناسب إجراءات التشغيل القياسية، معدات الوقاية الشخصية (المعاطف مختبر، أحذية واقية، وقفازات ومتقدمة القناع، والنظارات الواقية، إلخ) للممارسة BSL-2 مطلوب. للممارسة BSL-3، مجهزة بصندوق القفازات مصدقة وحدة مختبر بكر من الضغط السلبي. تتم ترقية وحدات المختبر قبل windows التمريري خارجي لحماية الأفراد في خطوة استلام العينة. يمكن تبسيط عملية التسجيل مع التطبيقات المستندة إلى الكمبيوتر اللوحي المتقدمة سابقا (الشكل 3D). يمكن استخدام التطبيقات الأخرى المقبولة التي يتم تشغيلها على جهاز كمبيوتر محمول، وكذلك.

يمكن إجراء هذا الاختبار التشخيصي الفيروس التنفسي خاصة في وحدات المختبر متصلة لفصل خطوات الإجراء التشخيصي عن قصد لتجنب التلوث أو احتمال التداخل بين الكواشف الكيميائية الحيوية، مما قد يؤثر على اختبار النتائج. لتحقيق أقصى قدر من جودة التشخيص، يستخدم ممارسة اختبار التشخيص السريع (ط) على حد سواء المختبرية الأساسية BSL-2 والغرفة PCR الاعتراضية متصلة (الفرع 3) أو (ثانيا) جيجابايت وبكر غرف متصلة بواسطة نافذة التمريري (القسم 4). ويرد في الشكل 6 الرسم التخطيطي لسير العمل المختبري المقترحة وتشدد على حماية شخصية. الرسم التخطيطي تعترف بأهمية كل خطوة المشار إليها لحماية الأفراد، ولا سيما إذا كان الحد الأدنى هو تدريب موظفي المختبرات في المناطق النائية.

ويتم إنجاز اختبار التشخيص السريع للأنفلونزا عن طريق تقنية RT-PCR. يحتوي الإجراء على أربع خطوات رئيسية. لاحظ أنه يتم تعيين مساحات العمل الفردية لكل مرحلة من البروتوكول.

الخطوة الأولى هي الحصول على عينة ودون تقسيمه إلى مختبرين عدة. مختبرين يمكن ثم ملحوظ مع الرموز الشريطية لتحسين فعالية الرقابة على البيانات وتخزينها في الثلاجة لإجراء مزيد من التحقيقات. والخطوة الثانية لإلغاء تنشيط نموذج في المخزن المؤقت لتحلل سينتريفوجينج والتدفئة. ويجب أن تنفذ الخطوات الأولى والثانية في خزانات السلامة البيولوجية. استخدام مجموعات ماصة الأفراد والمعدات. ويقترح اختبار PCR المراد تنفيذها في الغرفة بكر، إذا كانت متوفرة. والخطوة الثالثة هي الوثائق المتعلقة بالنتائج. الخطوة الرابعة هي الصيانة بعد استخدام المعدات، وتذكير لحماية الأفراد في نهاية التجربة.

إذا كانت العينة من المتوقع أن تصنف باعتبارها BSL-3 + (e.g.,Ebola، Zika، الصرف، السل) يجب استخدام مرفق صندوق قفازات. في المختبر البعيد، قد الغرفة غيغابايت إطاره تمريري الحصول على العينات والكمبيوتر المحمول أو الكمبيوتر اللوحي لنموذج التسجيل. عينة الكوة والفيروسات المنظمة يجب أن يؤديها في قاعة صندوق قفازات. الإضاءة البنفسجية يوصي بتجنب التلوث أثناء الإجراء. بعد المنظمة عينة، كذلك خطوات للبروتوكول مشابهة للمختبرات الأساسية BSL-2 واختبار BSL-3 وفيما يلي "قائمة الجزء الثالث" (الجدول 1، الشكل 6)-

الشكل 1. نموذج مرفق المختبر. (أ وب) وضع النقل؛ (ج) وضع نشرة: في الخارج؛ (د) وضع نشرة: الداخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . تخطيطات. (أ) المختبرية الأساسية BSL-2؛ (ب) وحدة نمطية BSL-3 يتضمن صندوق قفازات ومختبرات بكر، لها نافذة تمريري مشتركة لنقل العينة المحمية؛ (ج) مرافق المختبرات متصلة (أ) و (ب) مع المرافق المشتركة. (د،ه) صور فوتوغرافية لوحدات متصلة من طرفي نقيض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

الشكل 3. الداخلية (أ) مرفق BSL-3 وقد (1) نافذة تمريري، بالوعة ومحطة ايوش (2) في المدخل؛ (ب) موصلات الطاقة الكهربائية، الموصلات الماء (ج)؛ (د) البرامج المستندة إلى الكمبيوتر اللوحي للإمدادات نتيجة مختبر وتتبع الوثائق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 . النشر مرفق المختبر. تعليمات للوحات التي تتكشف في جانب واحد للوحدة كما هو موضح (أ-د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

الشكل 5 . الخطط للمختبر قابل للاتصال: (أ) BSL-2 الوحدة النمطية 1؛ (ب) صندوق قفازات وبكر 2 وحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

الرقم 6 . الرسم البياني لاختبار فيروس تنفسي RT-PCR تشخيص في مرفق مختبر بعد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مختبر بعد BSL-2	مختبر بعد BSL-3
الجزء الأول	الجزء الأول
أولاً التكنولوجيا مختبر بالدخول من خلال الباب المسمى مدخل ومعطف المعمل، الذي هو معلق على الرف بجوار باب المدخل. أحذية مفتوحة محظورة، وتشجع قناع متقدمة والنظارات الواقية.	أولاً يتم تنشيط التكنولوجيا مختبر للنظر في إطار صندوق قفازات من خارج الوحدة لضمان الضغط السلبي. (الوردي الكرة يجب أن تكون مرئية في وحدة لإظهار يعمل الضغط السلبي).
ثانيا-مختبر التكنولوجيا غسل اليدين في الحوض ووضع قفازات القابل للصرف وتبدأ مع كمية عينات.	ثانيا-إذا كان يعمل بالضغط السلبي، مختبر التكنولوجيا للدخول عن طريق الباب الوحيد ووضع على معطف المعمل، الذي هو معلق على الرف بجوار باب المدخل.  أحذية مفتوحة محظورة، قناع متقدمة والنظارات الواقية ومن المستصوب.
ثالثا-العينات التي كانت انخفضت في حمام هيبوكلوريت قبل السقوط في نافذة التمريري يجلسون في تمرير من خلال لمختبر التكنولوجيا.	ثالثا-مختبر التكنولوجيا غسل اليدين في الحوض، وضع قفازات المتاح، معدات الوقاية الشخصية وتبدأ مع كمية عينات.
رابعا-وردت في استقبال العينة.	رابعا-العينات التي كانت سابقا انخفض في حمام هيبوكلوريت قبل السقوط في تمرير من خلال نافذة يجلسون في تمرير من خلال لمختبر التكنولوجيا.
الجزء الثاني	خامسا – تلقي في استقبال العينة.
خامسا – اعتماداً على الإجراء التشخيصي، انتقلت إلى مجلس الوزراء السلامة الأحيائية العينات ومعطّل.	الجزء الثاني
سادسا-عينات هيأهم للفحص المجهري، وأجهزة الطرد المركزي، أو التعفن.	سادسا-العينات غير نشط في علبة القفازات.
تشغيل اختبارات التشخيص سابعا المناسبة.	سابعا-العينات المنفذة لعزل الحمض النووي.
ثامنا-تخزين العينات في الثلاجة 4 درجات مئوية أو الثلاجة المناسبة.	ثامنا بعد الاستخراج، نقل العينات إلى نافذة التمريري.
الجزء الثالث	تاسعا-مختبر التكنولوجيا تدخل عن طريق مدخل في الجانب بكر وحدة (الضغط الإيجابي).
تاسعا-استخدام الحوض لتلطيخ & الغسيل من العناصر.	عاشرا-فني مختبر وضع على معطف مختبر من الرف بجوار المدخل، غسل اليدين في الحوض، وضع قفازات.
عاشرا – استخدام الكمبيوتر المحمول & كونتيربيس لإجراء التحليلات والوثائق.	حادي عشر-تلقي عينات من الغرفة صندوق قفازات في إطار التمريري.
حادي عشر-تعقيم المعدات عن طريق تشغيل اﻷوتوكﻻف.	ثاني عشر-إذا هيأهم العينات اللازمة في تدفق رقائقي مجلس الوزراء.
ثاني عشر-التخلص من أي نفايات اوتوكلاف في حاوية النفايات واقية.	تشغيل اختبارات التشخيص الثالث عشر. المناسبة.
ثالث عشر-غسل اليدين في الحوض.	رابع عشر-تخزين العينات في الثلاجة 4 درجات مئوية أو الثلاجة المناسبة.
رابع عشر-شنق معطف مختبر مرة أخرى على الرف.	الجزء الثالث
خامس عشر-أخرج من خلال الباب نفسه.	خامس عشر-استخدام الحوض لتلطيخ & الغسيل من العناصر.
	سادس عشر-استخدام الكمبيوتر المحمول & كونتيربيس لإجراء التحليلات والوثائق.
	سابع عشر-نقل قنينات نافذة تمريري إلى غرفة بكر وتعقيم المعدات عن طريق تشغيل اﻷوتوكﻻف.
	ثامن عشر-التخلص من أي نفايات اوتوكلاف في حاوية النفايات واقية.
	تاسع عشر-غسل اليدين في الحوض.
	xx. الخروج عن طريق نفس باب المدخل.

الجدول 1. قائمة مرجعية لتشخيص بكر سير العمل.

الصيانة والتحديدات
أنظمة PCR الوقت الحقيقي	الشهري	إجراء معايرات خلفية كل شهر
	18 شهرا	أداء الخلفية، المكانية وصبغ معايرات كل الأشهرال 18
أجهزة الطرد المركزي	السنة 1	معايرة للثورات في الدقيقة ودرجة الحرارة من خلال خدمات المعايرة الخارجية أو الداخلية
صندوق قفازات	اليومية	فحص العناصر، خاصة بالنسبة للأضرار على الأسطح المكشوفة مرشحات HEPA، والقفازات، وسين بين عصابات وخراطيم بصريا. تأكد من مجرى الهواء المشابك ضيق وفي المكان. إجراء اختبار الضغط تسرب. اختبار الضغط ناقوس الخطر.
	6 أشهر	تغيير عامل تصفية هيبا
	السنة 1	معايرة نظام
اﻷوتوكﻻف	التنزيلات	تنظيف خزان الماء ورفوف استخدام مطهر غير الكاشطة معتدل
	3 أشهر	معايرة جهاز ضبط الوقت والمقاييس
	1 سنة أو كل 50 دورة	فحص وتنظيف جيدا، واختبار ومعايرة
ثلاجة وفرييزر	6 أشهر	فحص مروحة موتور، مبخر لفائف، كنس لفائف التكثيف ومرشحات [كندنسر] واستبدال البطاريات حسب الحاجة
	السنة 1	معايرة المجمد من خلال خدمات المعايرة الداخلية أو الخارجية

الجدول 2. صيانة المعدات PCR الوقت الحقيقي.

إلزامية	وأوصى
معطف مختبر، وأحذية واقية، وقفازات	معطف مختبر، أحذية واقية، والقفازات، والأقنعة، نظارات
ثلاجة 4 درجة مئوية، والمجمد-20 درجة مئوية	ثلاجة 4 درجة مئوية، والمجمد-20 درجة مئوية، المجمد-80 درجة مئوية
مجموعة واحدة من الماصات الآلي	ثلاث مجموعات من الماصات الآلي
أجهزة الطرد المركزي، وشاكر، ثيرموسيكلير	نظام الروبوتية
RT-PCR الجهاز، حمام الثلج	RT-PCR مع التحكم في درجة الحرارة، برودة خاليا من الجليد
أكياس النفايات واقية	اﻷوتوكﻻف للتخلص من النفايات واقية

الجدول 3. اختبار الحد الأدنى من المتطلبات لتشخيص الفيروس التنفسي RT-PCR BSL-2.

Discussion

مرفق مختبر بعد المذكورة أعلاه لوجستيا المنحى وقابلة للتوسيع، وسرعة الانتشار، متعددة الوظائف، واستنادا إلى مفاهيم التصميم التي تتمحور حول الإنسان التي كانت موجهة لحماية كفاءة الموظفين ومساحة عمل المختبر. ووضع البروتوكول مفصلاً لإنشاء مختبر سريع وعزل الفيروس التنفسي آمنة والتشخيص وقدم.

يجب الحفاظ على الشروط التالية لتشغيل المعدات الأمثل، في وحدات المختبر: درجة الحرارة المحيطة 21 ± 2 درجة مئوية ودرجة الحرارة المسموح بها من 5 إلى 40 درجة مئوية والرطوبة من 14 ± 5% رطوبة نسبية، الرطوبة النسبية القصوى المسموح بها من رطوبة نسبية 80% (بدون تكاثف)، وارتفاع يتراوح بين 0 و 000 2 متر فوق مستوى سطح البحر.

استهلاك الطاقة واحدة من أهم البارامترات للإدارة للمختبرات خارج الشبكة. للمعدات المختبرية الأساسية، يمكن أن تختلف كفاءة الطاقة 15-40 ٪؛ ومع ذلك، يقدر متوسط استهلاك الطاقة هنا لتقديم خدمة مناسبة. أعلى معدل للطاقة (1,500-2,000 W) تتصل بأجهزة تكييف الهواء ونظام الدرج الأمامي وجهاز PCR ومعقم اﻷوتوكﻻف. النظر 8 ساعات عمل المكثف التي تقوم بتنفيذ البروتوكول و 16 ساعة لمراقبة البيئة مختبر، استهلاك الطاقة اليومي لوحدات المختبر ما يقرب 36 كيلووات ساعة/يوم ل BSL-2 وحوالي 43 كيلووات ساعة/يوم ل BSL-3 73 كيلوواط ساعة/يوم بالنسبة متصل BSL-2/BSL-3 + مرافق. لوحدة واحدة، نوصي بتوفير مصدر للطاقة الكهربائية مع قدرة إيه إيت طاقة التشغيل/مستمر/ابتداء من ارتفاع الطاقة كيلوواط، إيه وان زيرو كيلو واط؛ مرفق متصلة، طاقة التشغيل/المستمر إيه وان تو كيلو واط، وبدءا من الطفرة/السلطة إيه وان فور كيلو واط. ملاحظة، في مرفق مختبر BSL-3، ينصح بشدة مصدر طاقة احتياطية لتجنب انقطاع الكهرباء عرضي وضمان العمل المطرد لنظام الضغط السلبي وصندوق قفازات أثناء اختبار تشخيصي.

مولد بنزين بالطاقة كهربائية حل فعالة من حيث التكلفة لإمدادات الطاقة في حالات الطوارئ. نفترض أن كفاءة الوقود للمولدات البنزين حوالي 1.5 غالون في مدار في حمولة 100%. ثم، إذا كان متوسط استهلاك الطاقة اليومي تحميل 8 ساعات من 40% 16 ساعة تحميل 10%، وحدة المختبر BSL-2 أو BSL 3 تتطلب 7-9 غالون من الوقود يوميا، في المقابل، ومرفق متصلة احتياجات غال ~ 15/يوم.

الوحدات مختبر بعد مصممة لتناسب قدرات أنظمة شمسية خارج الشبكة. الألواح الشمسية لا تحتاج إلى وقود إضافي، ويمكن أن تعمل بإنتاجية عالية في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية في أفريقيا وآسيا وأمريكا اللاتينية بسبب الإشعاع الشمسي العالي. في الوقت الراهن، وحدة واحدة من نظام الألواح الشمسية المتاحة تجارياً يسمح استخدام طاقة يومية لتصل إلى 44 كيلوواط ساعة/يوم.

بغض النظر عن النوع المحدد من مصدر بديل للطاقة الكهربائية، أوصى بشدة مرشحات الكهرباء القذرة ومسبقا في مرافق مختبرية لتحسين نوعية الطاقة وحماية المعدات المختبرية. الحفاظ على نظام PCR بعيداً عن مصادر الإشعاع الكهرومغناطيسي القوى ودون رادع لأن الإشعاع الكهرومغناطيسي قوية قد تتداخل مع الأداء السليم للجهاز. كما أنها تفعل المهم عدم استخدام مصادر النظام PCR بالقرب من الاهتزاز القوى، مثل أجهزة الطرد المركزي أو مضخة للاهتزاز المفرط سوف يؤثر على أداء الصك. قد يمكن تثبيت معدات المختبرات فقط في بيئة له نونكوندوكتيفي الملوثات، مثل ذرات الغبار أو رقائق الخشب. ضمان الغرفة بعيداً عن أي فتحات يمكن أن تطرد المواد الجسيمية على مكونات الصك.

استخدام مختبر المياه يتوقف على عدد من الاختبارات التشخيصية التي تعمل يوميا وعدد من فنيي المختبرات العاملة في المنشأة. مطلوب من أجل إعداد خلاطات أثناء إجراء التشخيص بما في ذلك استخراج واختبار PCR نوكلاس المياه مجاناً ويجب أن يتم تسليم اللوازم مقدما عن الأخرى، والمواد الكيميائية. هناك حاجة إلى مالا يقل عن 50 مل مياه مجاناً نوكلاس لتشغيل اختبار تشخيص واحد؛ حجم المطلوب من المياه مجاناً نوكلاس يعتمد على حجم العمل (أي، على عدد من العينات). الماء المقطر هو المطلوب لتشغيل معقم اﻷوتوكﻻف. استهلاك المياه اﻷوتوكﻻف في دورة واحدة 160-180 مل؛ ويوصي في اﻷوتوكﻻف للاستخدام اليومي. معظم المواد البلاستيكية (أنابيب، ونصائح ماصة، إلخ) المتاح، ولكن بعضها يمكن إعادة استخدامها وتحتاج إلى غسلها (حاويات كبيرة، رفوف، إلخ.). يتم استخدام المياه الجارية العادية لغسل اليدين بين الإجراءات ويقدر حجمه الحد الأدنى لتكون 15-20 لتر يوميا. الماء يحتاج إلى ضخ للضغط؛ يوصي بالرواسب قبل تصفية نظام لحماية أجهزة المياه من التأثير الضار للرواسب وتحسين نوعية المياه الجارية.

للتخزين البارد، ثلاجة 5.1 قدم مكعب واحد على الأقل (+ 4 درجة مئوية) وواحد 4.9 قدم مكعب (-20 درجة مئوية إلى-30 درجة مئوية) المجمد مطلوبة في كل وحدة المختبر لتخزين العينات/الجيش الملكي النيبالي.

مختبر التلوث تشمل عدة مستويات: تنظيف > مراجعتان > التطهير > التعقيم. تنظيف بسيطة يمكن أن يؤديها باستخدام الماء والصابون أثناء الغسل مع القفاز اليد أو الفرشاة. ويشمل مراجعتان الغسيل مع مضادات الميكروبات السائلة الكيميائية كي تمنع نمو وتكاثر الجراثيم. حلول الكحول (70%) يمكن استخدامها كسائل مطهر. التعقيم هو تطبيق مادة كيميائية سائلة للقضاء على ما يقرب من جميع الأحياء المجهرية الممرضة (باستثناء الجراثيم البكتيرية) على أسطح العمل والمعدات. وقت التعرض للمواد الكيميائية ودرجات الحرارة، وتركيز المطهرات هامة. محلول هيبوكلوريت الصوديوم (0.5%)، أو التبييض، مطهر فعال على نطاق واسع لتنقية المياه وتنقية السطحية. البنفسجية مبيد للجراثيم طريقة أخرى للتطهير. مصباح مبيد للجراثيم تنتج ضوء الأشعة فوق البنفسجية-C، ويؤدي إلى المنظمة من البكتيريا والفيروسات. التعقيم يستخدم إجراء الفيزيائية أو الكيميائية لتدمير الحياة الجرثومية كافة-بما في ذلك الجراثيم البكتيرية شديدة المقاومة. يمكن إجراء التعقيم مع معقم اﻷوتوكﻻف.

يجب فصل كل مختبر النفايات عند نقطة الجيل. مكان النفايات الصلبة، غير حادة، والمعدية في أكياس النفايات مانعة للتسرب علامة واقية. إذا كانت النفايات المنتجة حادة، فإنه يجب أن توضع في حاويات مقاومة للثقب. جمع النفايات السائلة يحتمل أن تكون معدية في حاويات واقية المسماة بشكل صحيح للسوائل. حاويات وأكياس ينبغي عدم شغل أكثر من 2/3 وحدة التخزين. يجب أن يتم فرز التخلص من جميع منتجات التبييض إلى بن النفايات المعينة الخاصة بهم. يجب معالجة النفايات المخبرية برفق لتجنب توليد الهباء الجوي والكسر من أكياس/الحاويات. يجب أن تكون أكياس/صناديق جمع النفايات واقية مع الأسطح الخارجية ومختومة تطهير بعد الاستخدام مع محلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.5%. تعقيم كل معمل النفايات في اﻷوتوكﻻف على 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الحرق. الرجوع إلى دليل عمل للاستخدام السليم اﻷوتوكﻻف. إذا كان ذلك ممكناً، إضافة مؤشر كيماوية أو بيولوجية إلى اﻷوتوكﻻف لضمان التعقيم السليم. يجب أن تكون جميع النفايات الصلبة والسائلة يعقم المسمى بوضوح كتعقيم مع الإعداد والتاريخ، والوقت، والمشغل. ثم يجب أن توضع النفايات المسمى في منطقة آمنة منفصلة قبل الحرق.

كما هو متوقع، يتوقف سير العمل للاختبار التشخيصي على المرض والعينة. إذا كان من المستحسن لتحديد هوية الفيروس لجمع عينات الدم (مثل فيروس إيبولا¹⁹)، يمكن تخزين العينة مختبرين في-20 درجة مئوية بدلاً من-80 درجة مئوية (اللازمة للبحث عن فيروسات الجهاز التنفسي). من الأفضل دائماً أن عينة واحدة أو أكثر عند أخذ العينات من مريض من تقسيم العينات في وقت لاحق. إذا كان ذلك ممكناً، يجب اتخاذ العينات اثنين على الأقل لكل نوع من العينات في أنابيب عينات منفصلة. يجب أن تكون العينات الفرعية المقسمة إذا لم يكن ممكناً أخذ العينات الإضافية.

إذا كان لا يمكن تخزين العينات البديلة في درجات الحرارة المناسبة (مثلاً، لا المجمدات متاحة)، يجب تخزين مسحات النقي (100%) الإيثانول أو 99% ميثليته روح (إضافات الميثانول فقط). وفي هذه الحالة، يجب أن يوضع طرف مسحه في قنينة مع 1-2 مل إيثانول. علما بأن هذه العينات مناسبة فقط لبكر. أيضا، علما بأن مقايسة راسخة ضروري لكل^8،تشخيص الفيروس خاصة²³، ويجب أن ترسل عينات الفيروس غير معروف إلى المختبرات المخصصة لمواصلة التحقيقات^{19،20، 21}.

يجب الاعتراف بالمتطلبات الإلزامية والموصى به إلى القائمة المعدات المختبرية لاختبارات PCR تشخيص الفيروس التنفسي. ويؤكد الجدول 3 المعدات الأساسية والمتقدمة الحد الأدنى (مستحسن) ومتطلبات الاختبار التشخيصي RT-PCR. للممارسة BSL-3، حماية الضغط السلبي إضافية (مثلاً، صندوق قفازات) موظفي حاسمة وضرورية.

وحدات المختبر متصلة الأفضل زيادة عدد الأفراد المشاركين في التجارب المختبرية وتسريع الوقت اللازم لاختبار واحد. الاستعاضة عن استخراج الحمض النووي الريبي اليدوية تستغرق وقتاً طويلاً من الممكن مع qPCR الآلي (مثلاً، قياكوبي). بينما هذا الصك مرهقة (عرض 65 سم، الطول 62 سم، ارتفاع 86 سم)، يمكن أن يصلح مساحة المختبر المتنقل بعد إعادة ترتيب الأثاث في وحدات BSL-2 أو BSL 3.

سوف تركز العمل في المستقبل على تطوير واقع زيادة (ع) ودورات تدريبية في الواقع الافتراضي (VR). نظارات ع/VR ستستخدم لتوفير منصة تفاعلية لتعليم المهارات المطلوبة اللازمة لكي تصبح عامل مختبر المدربين تدريبا جيدا. نصائح مفيدة لتنفيذ بعض الإجراءات صعبة ومتعددة الخطوات في اختبارات التشخيص المختبري ستدرج في دليل البرامج. هذا النهج لتدريب الأفراد ينبغي تحسين نوعية أداء الاختبار التشخيصي وإدارتها في مرافق مختبرية البعيد، لا سيما بعد والمناطق المحدودة الموارد.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave Sterilizer 'BioClave'	Benchmark Scientific, Edison, NJ, USA	B4000-16	16 liter, Benchtop, Dims: 22x17.5x15.7 in, Fully automatic, Extremely Compact
Barcode Scanner	Zebra Technologies ZIH Corp., Lincolnshire, IL, USA	Symbol LS2208	Handheld, lightweight
Breaker Box Panelboard Enclosure	Square D (Schneider Electric), France	MH62WP	NEMA 3R/5/12, Dims: 20 W x 62 H x 6-1/2 in. D, Electrical distribution board
Centrifuge - Microcentrifuge 17,000 x g	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	75002440	Holds 24 x1.5 or 2 ml tubes, Dims: 8.9x9.6x13.8 in
Class II Biological Safety Cabinet	NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA	NU-602-400	4 Ft. Class II Type A2 Cage Changing Biological Safety Cabinet, 12" Access Opening, HEPEX Pressure Duct
Class III Biological Safety Cabinet (Glove box)	Germfree Laboratories, Ormond Beach, FL, USA	Model #PGB-36, Serial #C-2937	Glove box, Portable, 36", Class III BSC. Dims: 36x20x23.75 in, Includes 2 interior outlets
Cryo Coolers	VWR, Radnor, PA, USA	414004-286	0.5 or 1.5 ml tube benchtop coolers
Freezer (30°C freezer)	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	Model ULT430A	To occupy 4.9 Cubic feet
Laminar Flow Cabinet	NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA	NU-126-300	3 Ft. Vertical Laminar Airflow Cabinet, 8" Access Opening, HEPA filter supply, 99.99%
Mini Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	75004061	Dims: 4.1x5.0x6.0 in
Pipettes automated	VWR, Radnor, PA, USA	05-403-151	Pipet 4-pack (2.5,10, 100 and 1,000μL volume)
Pipettes automated 'Finnpipette'	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	4700880	Pipet 4-pack (2, 20, 200 and 1,000μL volume), Advanced Volume Gearing(AVG), Ultra durable
Power Generator	Cummins Power Generation, Minneapolis, MN, USA	C60 D6	60 kW, 60 Hz, 1 Phase, 120/240V, Diesel
Refrigerator	BioMedical Solutions, Inc., Stafford, TX, USA	BSI-HC-UCFS-0504W	Standard Undercounter Refrigerators & Freezers
Refrigerator	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	05LRAETSA	To occupy  5.1 Cubic feet
RT-PCR machine 'Step-one plus'	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	4376598	Holds 96 samples, Dims: 9.7x16.8x20.2 in
Vortex Mix	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	88880017TS	Dims: 6.1x8.3x3.3 in
Chemicals
AgPath-ID One-Step RT-PCR Reagents	Applied Biosystems, Foster City, CA, USA	4387391
Ethanol Koptec Pure 200 Proof	Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA	V1001
Nuclease-free Water	Ambion, Inc., Carlsbad, CA, USA	AM9906
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	52906
SuperScript III Platinum One-Step qRT- PCR Kit	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	11732-088
Disposable
1 mL cryogenic tubes	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	03-337-7X
1.5 mL tubes	VWR, Radnor, PA, USA	10025-726
10 µL Filter Tips	Neptune, VWR, Radnor, PA, USA	Neptune, BT10XLS3
20 µL Filter Tips	Multimax, BioExpress, VWR, Radnor, PA, USA	MultiMax, P-3243-30X
200 µL Filter Tips	ART, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	ART, 2770
1000 µL Filter Tips	Phenix Research Products, Candler, NC, USA	TS-059BR
AB custom probes	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	N/A	Custom probes
Combitips	Eppendorf, Hauppauge, NY, USA	89232-972
Integrated DNA Technology (IDT) custom probes and primer	IDT	N/A	Custom probes
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	490003-978 CS
MicroAmp Fast Reaction Tubes (8 tubes/strip)	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	4358293
MicroAmp Optical 8-Cap Strip	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	4323032
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA	4311971
Supplies
Biohazard waste bags	VWR, Radnor, PA, USA	14220-046	20.3 x 30.5 cm Biohazard bags
Gloves	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	G4162-250	Small, meduim or large Nitrile or latex gloves
Lab coat	N/A	N/A	Customizable
Masks	VWR, Radnor, PA, USA	414004-663	Advanced protection mask
Protective shoes	N/A	N/A	Customizable