以波马利多米德为基础的人种-PROTACs对E3泛基金的化学灭活

摘要

这项工作描述了一种基于波马利多米德的合成和表征,即一种基于双功能的同质性PROTAC,作为诱导E3泛性联苯基雷布龙(CRBN)的泛化和降解的新方法,该物质是沙利度胺类比靶的目标。

摘要

免疫调节药物 (IMiDs) 沙利度胺及其类似物, 利利多米德和波马利多米德, 所有FDA批准的药物用于治疗多发性骨髓瘤, 诱导淋巴转录因子伊卡罗斯 (IKZF1) 和 Aiolos 的泛化和降解(IKZF3)通过脑蛋白酶(CRBN)E3泛蛋白联苯,用于蛋白酶降解。IMiDs最近被用于生成双功能蛋白解靶向嵌合物(PROTACs),以针对CRBN E3附和酶的泛化和蛋白酶降解的其他蛋白质。我们设计并合成了基于波马利多米德的同质功能PROTC,并分析了它们诱导CRBN自导无化和降解的能力。在这里,CRBN同时充当E3泛基丁和靶子。同质-PROTAC化合物8降解CRBN具有高效力,对IKZF1和IKZF3仅产生最小剩余影响。化合物8的CRBN失活对细胞活力和不同多发性骨髓瘤细胞系的增殖没有影响。这种同质性PROTAC可以废除多发性骨髓瘤细胞中IMiD的作用。因此,我们的同质性波马利多米德化合物可能有助于识别CRBN的内源基质和生理功能,并研究IMiD的分子机制。

引言

免疫调节药物 (IMiDs) 沙利度胺及其类似物, 利利多米德和波马利多米德, 所有批准用于治疗多发性骨髓瘤, 结合 E3 泛素结合脑素 (CRBN), 基质适配器的 cullinin4A-RING E3 泛素结合(CRL4^CRBN)^1,2,3.IMiD 的结合增强了 CRL4^CRBN与淋巴转录因子 Ikaros (IKZF1) 和 Aiolos (IKZF3) 的亲和力,导致其泛化和降解(图 1)^{4,5 ,6,7,8}. 由于 IKZF1 和 IKZF3 对多发性骨髓瘤细胞至关重要,因此它们的失活会导致生长抑制。SALL4最近被发现作为CRBN的另一种IMiD诱导的新基质,可能是导致致畸和所谓的康特甘灾难在1950年代由沙利多米德9,10造成的。相反,卡辛激酶1+(CK1+)是CRBN的一种利利多米德特异性基质,与染色体5q^缺失11的骨髓增生综合征的治疗效果有关。

小分子靶向特定蛋白质降解的能力是现代药物开发中令人振奋的一个暗示。虽然沙利度胺及其类似物的机制是在人类首次使用后发现的,但所谓的Proteolyis Targeting Chimeras (PROTACs) 被设计为专门针对感兴趣的蛋白质 (POI)(图2)^{12,13,14,15,16,17,18}。PROTACs 是异体功能分子,由 POI 的特定配体组成,通过链接器连接到 E3 泛性联苯的配体,如 CRBN 或 von-Hippel-Lindau (VHL)18、19、20^{、 21,22}.PROTACs诱导形成瞬态三元复合物,将POI定向到E3泛基质连体酶,导致其泛化和蛋白酶降解。与常规抑制剂相比,PROTACs的主要优点是,与POI结合就足够了,而不是其抑制作用,因此PROTACs可能针对更广泛的蛋白质,包括那些被认为无法药物的蛋白质,转录因子¹⁵.此外,嵌合分子具有催化作用,因此具有高效力。在泛基辛转移到POI后,三元复合物分离,可用于形成新的复合物。因此,非常低的PROTAC浓度足以降解靶^蛋白23。

在这里,我们描述了一个波马利多米德-波马利多米德共聚物(化合物8)的合成,它招募CRBN来降低自身24。E3 泛基苯甲二苯CRBN 同时充当招募者和目标(图 3)。为了验证我们的数据,我们还合成了负绑定控制(化合物9)。 我们的数据证实,新合成的同质性PROTAC是CRBN降解的特异性,对其他蛋白质的影响最小。

研究方案

1. PROTAC分子的制备

注意:使用前请查阅所有相关材料安全数据表 (MSDS)。这些合成中使用的几种化学品具有毒性和致癌性。请使用所有适当的安全操作和个人防护设备。

1. 制备三丁基N-(2,6-二恶英-3-烟酸)碳水化合物(化合物1)
   1. 在带搅拌棒并配有反流冷凝器的100 mL圆形底瓶中,在100 mL圆形瓶中加入1,1'-碳二甲酰胺(1.95克,12毫摩尔)和4-(二甲基氨基)丙氨酸(5mg)的混合物(2.46克,10毫摩尔)。回流时加热10小时,搅拌至形成清晰的溶液。
   2. 用旋转蒸发器在减压下去除溶剂,加入EtOAc(200 mL),并将其转移到分集漏斗中。用H2 O(50 mL)和盐水(50 mL)清洗有机层,并在Na₂SO₄上干燥。
   3. 通过短垫的硅胶(5 厘米直径和 5 厘米高)过滤溶液,再用埃托克的体积(200 mL)渗滤溶液。
   4. 蒸发溶剂,在真空中干燥获得的无色固体。
2. 制备三丁基N-(1-甲基-2,6-二恶英-3-烟酸)碳水化合物(化合物2)
   1. 将化合物1 (2.28 g, 10 mmol) 与研磨的碳酸钾 (2.76 g, 20 mmol) 和 DMF (25 mL) 结合在 100 mL 圆底瓶中。使用注射器加入碘多甲烷(1.42克、0.62 mL、10 mmol),为烧瓶配备被刺穿的橡胶隔膜。将反应容器放入超声波浴中 2 小时。
   2. 用EtOAc(100 mL)稀释反应混合物并将其转移到分集漏斗中。用 1 N NaOH (2x 25 mL)、H₂O (25 mL) 和盐水 (25 mL) 清洗有机层,并在 Na₂SO₄上将其干燥。
   3. 过滤并蒸发溶剂。使用石油醚/EtOAc(2:1)在硅胶(6厘米柱直径和20厘米高)上通过柱色谱法净化产品。
3. 制备 2-(2,6-二恶英-3-yl)-4-氟索林-1,3-二烯(化合物3)
   1. 将3-氟乙胺氢化物(1.25克,7.5毫摩尔)、谷氨酸1(1.14克,5毫摩尔)和醋酸钠溶液(0.50克,6.0毫摩尔)结合在50 mL圆形底瓶中,带搅拌棒并配有反流冷凝器。 将混合物加热至120°C6小时。
   2. 冷却后,将紫色混合物倒入H₂O(100 mL)上,搅拌10分钟。通过过滤收集成型的固体,用H₂O(3 × 5 mL)和石油醚(3 ~5 mL)洗涤,在真空中干燥。
4. 制备4-氟-2-(1-甲基-2,6-二氧乙酰-3-基)异氨酸-1,3-二烯(化合物4)
   1. 将3-氟乙胺氢化物(1.25克,7.5毫摩尔)、谷氨酸2(1.21克,5毫摩尔)和醋酸钠溶液(0.50克,6.0毫摩尔)结合在冰川醋酸(20 mL)中的100 mL圆形底瓶中,带搅拌棒并配有反流冷凝器。 将混合物加热至120°C6小时。
   2. 冷却后,将紫色混合物倒入H₂O(100 mL)上,搅拌10分钟。通过过滤收集成型的固体,用H₂O(3 × 5 mL)和石油醚(3 ~5 mL)洗涤,在真空中干燥。
5. 制备三丁基N-2-2-2-*2-2-2-2-2-2-2-二恶英-1,3-二恶英-异二醇-4-yl_氨基甲氧乙基_碳水化合物(化合物7)
   1. 用三丁基N-[2-+2-2-(氨基)乙基乙酸二甲酸酯(5,0.41克,1.65毫摩尔)、化合物3(0.41克,1.50毫摩尔)、干DMF(10 mL)和DIPEA(0.39克,0.51 mL,3.0mmol)充电50mL圆底瓶。 配有搅拌棒和回流冷凝器。在 90°C 的高温下加热 10 小时。
   2. 冷却至室温后,将深绿色混合物倒入H₂O (100 mL)上,并在分集漏斗中用 EtOAc (3x 50 mL) 萃取。用H₂O (50 mL) 和盐水 (50 mL) 清洗组合的有机层,在 Na₂SO₄上干燥,过滤,并浓缩在真空中。
   3. 使用石油醚/EtOAc梯度(1:1至1:2)在硅胶(3厘米柱直径和60厘米高)上通过柱色谱法净化原油产品。
6. 霍莫默的制备(化合物8)
   1. 将 β、α-二胺连结器 6(0.22 g、0.22 mL、1.50 mmol)、DIPEA(1.05 mL、6.00 mmol)和3(0.83克,3.00 mmol)溶液结合在50 mL圆形底烧瓶中,并配有反流器。 在 90°C 的高温下加热 18 小时。
   2. 冷却至室温后,将深绿色混合物倒入H₂O (100 mL)上,并在分集漏斗中用 EtOAc (3x 50 mL) 萃取。用H2 O(50 mL)和盐水(50 mL)清洗组合的有机层,在Na₂SO₄上干燥,过滤并浓缩在真空中。
   3. 使用石油醚/EtOAc梯度(1:2)至EtOAc,通过柱色谱在硅胶(3厘米柱直径和50厘米高)上纯化原油产品。
7. 异体制剂(化合物9)
   1. 将化合物7(0.83克,1.65毫摩尔)溶解在干CH 2 Cl ₂₍₁₀mL)中。加入三氟乙酸(10 mL),在40°C下搅拌黄色混合物2小时,在封闭的50 mL圆形底瓶中搅拌。
   2. 去除挥发物,用 CH₂Cl₂ (4x 5 mL) 进行共蒸发。将残留物在真空中干燥 10 小时。
   3. 在干燥的 DMF (20 mL) 中重新溶解材料。加入化合物4(0.44克,1.50毫摩尔)和DIPEA(0.78克,1.05 mL,6.00 mmol),并为烧瓶配备反流冷凝器。 在 90°C 的高温下加热 10 小时。
   4. 冷却至室温后,将深绿色混合物倒入H₂O (100 mL)上,并在分集漏斗中用 EtOAc (3x 50 mL) 萃取。用饱和的NaHCO 3(50 mL)、H₂O(50 mL)、10%KHSO₄₍₅₀ mL)、H₂O(50 mL)和盐水(50 mL)清洗组合有机层,在Na₂SO₄上干燥,过滤并浓缩在真空中。
   5. 使用石油醚/EtOAc梯度(1:2)至EtOAc,通过柱色谱在硅胶(3厘米柱直径和50厘米高)上纯化原油产品。
   6. 在核磁共振(NMR)上,通过1H NMR和13C NMR光谱在DMSO-d₆上阐明和验证分子结构(图5A化合物8,5B化合物9) 光谱仪。通过液相色谱-质谱法(LC-MS),在220~500nm下应用二极管阵列检测(DAD),检查两种化合物的纯度是否高于97%。

2. PROTAC分子的功能验证

1. PROTACCRBN降解的西方污点分析
   注:化合物的影响8和化合物9通过西方污点分析对CRBN蛋白水平进行了测试。此外,对IKZF1和IKZF3水平的影响也可得到确认(图 6).
   1. 样品制备
      1. 在DMSO中溶解化合物8和9,lenalidomide(Len)、pomalidomide(Pom)、MG132和MLN-4924,浓度为10mM,等分并储存在-80°C,直至进一步使用。
      2. 种子 1 x 10⁶ MM1S 细胞在 6 孔板中,带 2.5 mL 介质,用 100 nM 或 1 μM 化合物8或9处理细胞,24 小时。
      3. 处理后收获细胞,在700 x g,5分钟,4°C下离心。用冷1x PBS清洗细胞颗粒,去除剩余的介质,在700 x g、5分钟、4°C下离心,并丢弃上清液。重复此步骤一次。
      4. 莱沙缓冲液中的酶细胞(25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% 甘油, 1x 蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒) 在冰上10分钟, 离心机在320 x g 10分钟, 4°C.根据制造商的协议,通过双辛酸蛋白测定(BCA测定)采集上清液并确定蛋白质浓度。
      5. 变性蛋白质(15~30 μg/样品),具有1xLDS载荷缓冲液(5%2-甲壳乙醇),煮10分钟,75°C。
   2. SDS-PAGE
      1. 修复凝胶三明治与10%分离凝胶#4 mL 3x凝胶缓冲液(3M Tris/HCl, 0.3% (w/v) 硫酸钠 (SDS), pH 8.45), 4 mL 丙烯酰胺 30%, 2.52 mL 甘油 50%, 1.395 mL H₂O, 75 μL 11% 硫酸铵 (APS), 和 9.75 [L TEMED] 和 4% 堆叠凝胶 [1.992 mL 3x 凝胶缓冲液,0.792 mL 30% 丙烯酰胺、3.168 mL H₂O、36 μL 11% APS 和 6[L TEMED] 在电极组件单元中。拆下梳子,用阴极缓冲液冲洗孔(100 mM Tris/HCl,100 mM 三重体,0.1%(w/v)SDS),并装载样品。
      2. 将阳极缓冲液(100 mM Tris/HCl,pH 8.9)填充油箱。从步骤 2.1.1.4 加载蛋白质样本,以 70 V、20 分钟运行 SDS-PAGE,然后以恒定电压运行 115 V,150 分钟。
   3. CRBN、IKZF1和IKZF3的免疫印迹和检测
      1. 在100%甲醇中激活PVDF膜(0.45μm,1分钟.平衡膜和分离凝胶在1x转移缓冲液[10x转移缓冲液(192 mM甘氨酸,25 mM Tris-base/HCl,900 mL H₂O),20%甲醇,0.1%SDS,pH 8.3]。
      2. 根据制造商的协议组装印迹盒。在180 mA下转移凝胶90分钟。
      3. 在 1x TBS-T 中清洗膜 3 倍(25 mM Tris/HCl,150 mM NaCl,pH 7.6,0.1% 补间 20),在室温下每次清洗 5-10 分钟。在室温下将膜块在5%脱脂干牛奶(NFDM),TBS-T1小时。在室温下,在 1X TBS-T 中清洗膜 3 倍,每次清洗 5-10 分钟。
      4. 用CRBN原抗体孵育膜(1:500在5%BSA,TBS-T),在4°C处轻轻摇动,过夜。
      5. 在室温下,在 1X TBS-T 中清洗膜 3 倍,每次清洗 5-10 分钟。用抗小鼠(5% NFDM,TBS-T)或抗兔子(5% NFDM,TBS-T)的1:5.000与马萝卜过氧化物酶HRP(室温下1小时)结合的二次抗体孵育膜。
      6. 在室温下,将膜在 1X TBS-T 中洗涤 2 倍,每次清洗 5-10 分钟。使用 1x TBS 重复此步骤两次。
      7. 根据制造商的协议,使用HRP基板溶液孵育膜2分钟,并在化学发光检测装置中检测化学发光。
      8. 在1X TBS中清洗膜1倍,在室温下每次清洗5~10分钟。为了释放抗体,在市售的剥离缓冲液中剥离膜15分钟,在1X TBS中清洗膜3倍,在室温下各5~10分钟。
      9. 在5%脱脂干牛奶中重新粘附膜,TBS-T在室温下1小时。根据步骤 2.1.3.4,在室温下将膜在 1x TBS-T 中清洗 3 倍,每次 5-10 分钟,然后根据步骤 2.1.3.4 重新探针 IKZF1、IKZF3 或 Tubulin。
2. MG132、MLN4942 或 pomalidomide 的竞争实验
   注:为了确认CRBN是否通过泛基蛋白-蛋白酶体途径降解,我们用蛋白酶抑制剂MG132和内酰化活化酶(NAE)抑制剂MLN4942(图7)进行了竞争实验。
   1. 种子 1 x 10⁶ MM1S 细胞每孔在 6 孔板。预处理10μM MG132、10μM MLN4942或利纳利多米德(100x)的细胞,并在37°C下孵育1小时,CO₂为5%。
   2. 在37°C时加入100 nM化合物8,3小时,CO₂为5%。
   3. 根据步骤 2.1.1 为西部污点采集细胞。
3. 多骨髓瘤细胞系中的细胞活力测定
   注:此测定用于测试对细胞活力的影响,此外,通过预处理化合物8的细胞来对抗IId对多骨髓瘤细胞的影响(图8,图9A,B)。
   1. 种子 5 x 10⁴ MM1S 细胞每孔在 96 孔板中的生物三元片,用于可行性测定。对于西方印斑分析,种子 1 x 10⁶ MM1S 细胞每孔在生物三元板的 6 孔板。
   2. 用DMSO或100 nM、1 μM或10 μM化合物8、化合物9或波马利多米德处理细胞,在37°C、5%CO₂下孵育24小时、48小时或96小时。 对于救援实验,使用100 nM化合物8处理细胞3小时,在加入1μM波马利多米德之前或之后,孵育96小时。
   3. 根据制造商在板读取器上的协议或从 6 孔板中采集细胞进行西印子分析,使用发光细胞可行性测定测量 96 孔板发光。

结果

在这里,我们描述了基于同质的波马利多米德PROTAC用于CRBN降解的设计、合成和生物评价。我们的PROTAC与两个CRBN分子同时相互作用,形成三元复合物,诱导CRBN自泛化和原体降解,仅对波马利多米德诱导的新基质IKZF1或IKZF3产生最小剩余影响。

在以前公布的一系列基于波马利多米德的PROTAC^分子24中,化合物8...

讨论

此处描述的CRBN此类同质-PROTAC的设计依赖于波马利多米德与CRBN的具体亲和力,该设计已成功应用于众多异质功能PROTAC,并使得PROTAC 8的发展成为高度选择性CRBN降解剂。我们的分子的特异性已经通过蛋白体^分析24得到证实。对于基因介导的淘汰,排除和验证副作用是具有挑战性的和耗时的。此外,化学诱导的敲除是可逆的,快速和直接适用于广泛的细胞和组织^类?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1'-Carbonyldiimidazole	TCI chemicals	C0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)	Sigma-Aldrich	385506	Compound 6
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 %	Alfa Aesar	A12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 %	Acros	148270250	Toxic
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)	Carl Roth	3029.1
Aiolos (D1C1E) mAB	Cell signaling	15103S
Anti-CRBN antibody produced in rabbit	Sigma	HPA045910
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody	Sigma	7074S
Ammonium Persulfate	Roth	9592.2
Boc-Gln-OH	TCI chemicals	B1649
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7571
ChemiDoc XRS+	Bio-Rad	1708265
DMF, anhydrous, 99.8 %	Acros	348435000	Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 %	Acros	348445000	Extra Dry over Molecular Sieve
Glycine	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
Goat anti-mouse (HRP conjugated)	Santa Cruz biotechnology	sc-2005
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)	Thermo Scientific	1861280
Ikaros (D6N9Y) Mab	Cell signaling	14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm)	Merck	IPVH000010
Iodomethane, 99 %	Sigma-Aldrich	I8507	Highly toxic
Methanol	Sigma-Aldrich	32213-2.5L
Mg132	Selleckchem	S2619
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell	Bio-Rad	1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658004
MLN4942	biomol (cayman)	Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512)	Sigma	T5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 %	Alfa Aesar	A11801
Nonfat dried milk powder	PanReac AppliChem	A0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate	Thermo Scientific	136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Scientific	NP0008
Pierce BCA Protein Assay kit	Thermo Scientific	23225
Pomalidomide	Selleckchem	S1567
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	46430
sodium dodecyl sulfate	Carl Roth	183.1
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	A9539-500g
TEMED	Carl Roth	2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate	Sigma-Aldrich	89761	Compound 5
Tricin	Carl Roth	6977.4
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949-500ml
WesternBright ECL spray	Advansta	K-12049-D50