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Resumen

Este trabajo describe la síntesis y caracterización de un homo-PROTAC bifuncional basado en pomalidomida como un enfoque novedoso para inducir la ubiquitinación y degradación de la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), el objetivo de los análogos de la talidomida.

Resumen

La talidomida de los fármacos inmunomoduladores (IMID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos los medicamentos aprobados por la FDA para el tratamiento del mieloma múltiple, inducen ubiquitinación y degradación de los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3) a través de la ligasa de ubiquitina cereblon (CRBN) E3 para la degradación proteasomal. Los IMID se han utilizado recientemente para la generación de proteólisis bifuncional dirigida a quimeras (PROTAC) para apuntar a otras proteínas para la ubiquitinación y la degradación proteasomal por la ligasa CRBN E3. Diseñamos y sintetizamos PROTACfuncionales basados en pomalidomida y analizamos su capacidad para inducir la ubiquitinación autodirigida y la degradación de CRBN. Aquí, CRBN sirve como ambos, la ligada a la ubiquitina E3 y el objetivo al mismo tiempo. El compuesto homo-PROTAC 8 degrada CRBN con una alta potencia con sólo efectos restantes mínimos sobre IKZF1 e IKZF3. La inactivación de CRBN por compuesto 8 no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular y la proliferación de diferentes líneas celulares de mieloma múltiple. Este homo-PROTAC deroga los efectos de los ID En múltiples células de mieloma. Por lo tanto, nuestros compuestos homodíricos a base de pomalidomida pueden ayudar a identificar los sustratos endógenos y las funciones fisiológicas de CRBN e investigar el mecanismo molecular de los IMID.

Introducción

La litimida de los fármacos inmunomoduladores (IID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos aprobados para el tratamiento del mieloma múltiple, se unen a la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), un adaptador de sustrato para cullin4A-RING E3 ubiquitina ligerina (CRL4CRBN)1,2,3. La unión de los IMID mejora la afinidad de CRL4CRBN con los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3), lo que lleva a su ubiquitinación y degradación (Figura1)4,5, 6 , 7 , 8. Dado que IKZF1 e IKZF3 son esenciales para múltiples células de mieloma, sus resultados de inactivación en la inhibición del crecimiento. SALL4 fue encontrado recientemente como un neo-sustrato adicional inducido por el IMiD de CRBN que es probablemente responsable de la teratogenicidad y la llamada catástrofe de Contergan en la década de 1950 causada por talidomida9,10. Por el contrario, la caseína quinasa 1o (CK1o) es un sustrato específico de lenalidomida de CRBN que está implicado en el efecto terapéutico en el síndrome mielodisplásico con deleciones del cromosoma 5q11.

La capacidad de las moléculas pequeñas para apuntar a una proteína específica para la degradación es una implicación emocionante para el desarrollo de fármacos modernos. Mientras que el mecanismo de talidomida y sus análogos fue descubierto después de su primer uso en humanos, los llamados Proteólisis Targeting Chimeras (PROTACs) han sido diseñados para apuntar específicamente a una proteína de interés (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. Los PROTACACs son moléculas heterobifuncionales que consisten en un ligando específico para el PDI conectado a través de un vinculador a un ligando de una ligasa de ubiquitina E3 como CRBN o von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Los PROTAC inducen la formación de un complejo ternario transitorio, dirigiendo el PDI a la ligasa de ubiquitina E3, lo que resulta en su ubiquitinación y degradación proteasomal. Las principales ventajas de los PROTAC sobre los inhibidores convencionales es que la unión a un PDI es suficiente en lugar de su inhibición y, por lo tanto, los PROTAC pueden potencialmente apuntar a un espectro mucho más amplio de proteínas, incluidas las que se consideraron ingodibles como factores de transcripción15. Además, las moléculas quiméricas actúan catalíticamente y por lo tanto tienen una alta potencia. Después de la transferencia de ubiquitina al PDI, el complejo ternario se disocia y está disponible para la formación de nuevos complejos. Por lo tanto, las concentraciones muy bajas de PROTAC son suficientes para la degradación de la proteína diana23.

Aquí describimos la síntesis de un homo-PROTAC conjugado conjugado pomalidomida-pomalidomida (compuesto 8)que recluta CRBN para la degradación de sí mismo24. El CRBN de la ligasa de ubiquitina E3 sirve como reclutador y objetivo al mismo tiempo (Figura3). Para validar nuestros datos, también sintetizamos un control de enlace negativo (compuesto 9). Nuestros datos confirman que el homo-PROTAC recién sintetizado es específico para la degradación de CRBN y sólo tiene efectos mínimos en otras proteínas.

Protocolo

1. Preparación de moléculas PROTAC

ADVERTENCIA: Consulte todas las fichas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de su uso. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son tóxicos y cancerígenos. Utilice todas las prácticas de seguridad y equipos de protección personal adecuados.

  1. Preparación de carbamato tert-butilo N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)(compuesto 1)
    1. Añadir 1,1'-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) y una cantidad catalítica de 4-(dimetilamino)piridina (5 mg) a una mezcla de Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) en THF (50 ml) en matraz de fondo redondo de 100 ml con barra de agitación y equipado con un condensador. Calentar en el reflujo durante 10 horas mientras se revuelve hasta que se forme una solución clara.
    2. Retire el disolvente bajo presión reducida con un evaporador rotativo, agregue EtOAc (200 ml) y transfieralo a un embudo separador. Lavar la capa orgánica con H2O (50 mL) y salmuera (50 mL) y secarla sobre Na2SO4.
    3. Filtrar la solución a través de una almohadilla corta de gel de sílice (5 cm de diámetro y 5 cm de altura) y eluir con un volumen adicional (200 ml) de EtOAc.
    4. Evaporar el disolvente y secar el sólido incoloro obtenido en vacuo.
  2. Preparación de carbamato tert-butilo N-(1-metil-2,6-dioxo-3-piperidyl)(compuesto 2)
    1. Combine el compuesto 1 (2,28 g, 10 mmol) con carbonato de potasio molido (2,76 g, 20 mmol) y DMF (25 ml) en un matraz inferior redondo de 100 ml. Añadir yodometanono (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) en gota utilizando una jeringa y equipar el matraz con un tabique de goma perforado. Coloque el recipiente de reacción en un baño de ultrasonidos durante 2 h.
    2. Diluir la mezcla de reacción con EtOAc (100 ml) y transferirla a un embudo separador. Lavar la capa orgánica con 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 mL) y salmuera (25 mL), y secarla sobre Na2SO4.
    3. Filtrar y evaporar el disolvente. Purificar el producto por cromatografía de columna sobre gel de sílice (6 cm de diámetro de columna y 20 cm de altura) utilizando éter de petróleo/EtOAc (2:1).
  3. Preparación de 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindolina-1,3-dione (compuesto 3)
    1. Combinar 3-anhídrido de 3-fluoroftálicos (1,25 g, 7,5 mmol), glutamida 1 (1,14 g, 5 mmol) y una solución de acetato de sodio (0,50 g, 6,0 mmol) en ácido acético glacial (20 ml) en un matraz inferior redondo de 50 ml con barra de agitación y equipado con un condensador de reflujo. Calentar la mezcla a 120oC durante 6 h.
    2. Después de enfriar, verter la mezcla púrpura sobre H2O (100 mL) ymezclar durante 10 minutos.
  4. Preparación de 4-fluoro-2-(1-metil-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindolina-1,3-dione (compuesto 4)
    1. Combinar 3-anhídrido de sodio (1,25 g, 7,5 mmol), glutamida 2 (1,21 g, 5 mmol) y una solución de acetato de sodio (0,50 g, 6,0 mmol) en ácido acético glacial (20 ml) en un matraz de fondo redondo de 100 ml con barra de agitación y equipado con un condensador. Calentar la mezcla a 120oC durante 6 h.
    2. Después de enfriar, verter la mezcla púrpura sobre H2O (100 mL) ymezclar durante 10 minutos.
  5. Preparación de tert-butyl N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamato (compuesto 7)
    1. Cargue un matraz inferior redondo de 50 ml con tert-butilo N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamato (5, 0.41 g, 1.65 mmol), compuesto 3 (0.41 g, 1.50 mmol), DMF seco (10 mL) y DIPEA (0.39 g, 0.51 mMil, 3.01 mmol, 3.0mmol). Equipar con una barra de agitación y un condensador de reflujo. Calentar bajo la atmósfera de argón a 90oC durante 10 h.
    2. Después de enfriar a temperatura ambiente, vierta la mezcla de color verde oscuro en H2O (100 ml) y extraiga con EtOAc (3x 50 mL) en un embudo separador. Lavar las capas orgánicas combinadas con H2O (50 mL) y salmuera (50 ml), secar sobre Na2SO4, filtrar y concentrar en vacuo.
    3. Purificar el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (3 cm de diámetro de columna y 60 cm de altura) utilizando un gradiente de éter de petróleo/EtOAc (1:1 a 1:2).
  6. Preparación del homodímero (compuesto 8)
    1. Combine el vinculador de diamina 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 ml, 6,00 mmol) y una solución de 3 (0,83 g, 3,00 mmol) en DMSO seco (20 ml) en un matraz inferior redondo de 50 ml con barra de agitación y equipado con un conden de reflujo. Calentar bajo la atmósfera de argón a 90oC durante 18 h.
    2. Después de enfriar a temperatura ambiente, vierta la mezcla de color verde oscuro en H2O (100 ml) y extraiga con EtOAc (3x 50 mL) en un embudo separador. Lavar las capas orgánicas combinadas con H2O (50 mL) y salmuera (50 mL), secar sobre Na2SO4,filtrar y concentrar en vacuo.
    3. Purificar el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (3 cm de diámetro de columna y 50 cm de altura) utilizando un gradiente de éter de petróleo/EtOAc (1:2) a EtOAc.
  7. Preparación de heterodimero (compuesto 9)
    1. Disolver el compuesto 7 (0,83 g, 1,65 mmol) en CH2Cl2 seco (10 ml). Añadir ácido trifluoroacético (10 ml) y remover la mezcla amarilla a 40oC durante 2 h en un matraz inferior redondo cerrado de 50 ml.
    2. Retire los volátiles y coesecone con CH2Cl2 (4x 5 mL). Secar el residuo en vacuo durante 10 h.
    3. Vuelva a disolver el material en DMF seco (20 ml). Añadir compuesto 4 (0,44 g, 1,50 mmol) y DIPEA (0,78 g, 1,05 ml, 6,00 mmol) y equipar el matraz con un condensador de reflujo. Calentar bajo la atmósfera de argón a 90oC durante 10 h.
    4. Después de enfriar a temperatura ambiente, vierta la mezcla de color verde oscuro en H2O (100 ml) y extraiga con EtOAc (3x 50 mL) en un embudo separador. Lavar las capas orgánicas combinadas con NaHCO3 saturado (50 mL), H2O (50 mL), 10% KHSO4 (50 mL), H2O (50 mL) y salmuera (50 mL), secar sobre Na2SO4, filtro y concentrado en vacuo.
    5. Purificar el producto crudo por cromatografía de columna sobre gel de sílice (3 cm de diámetro de columna y 50 cm de altura) utilizando un gradiente de éter de petróleo/EtOAc (1:2) a EtOAc.
    6. Eluciado y verificar la estructura de la molécula (Figura5A compuesto 8, 5B compuesto 9) por 1H RmN y 13Espectros de RMN C en DMSO-d6 en una resonancia magnética nuclear (RMN) Espectrómetro. Compruebe que la pureza de ambos compuestos sea superior al 97% mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), aplicando una detección de matriz de diodos (DAD) a 220–500 nm.

2. Validación funcional de moléculas PROTAC

  1. Análisis de la mancha occidental de la degradación de la CRBN por PROTACs
    NOTA: Los efectos del compuesto8y compuesto9en el nivel de proteína CRBN se probaron mediante el análisis de manchas occidentales. Además, también podría confirmarse el impacto en los niveles de IKZF1 e IKZF3 (Figura 6).
    1. Preparación de muestras
      1. Disolver compuestos 8 y 9,lenalidomida (Len), pomalidomida (Pom), MG132, y MLN-4924 en DMSO a una concentración de 10 mM, alícuota y almacenar a -80 oC hasta su uso posterior.
      2. Semilla 1 x 106 células MM1S en una placa de 6 pocillos con medios de 2,5 ml y tratar células con 100 nM o 1 m compuesto 8 o 9 para 24 h.
      3. Cosecha de células después del tratamiento y centrífuga a 700 x g, 5 min, 4oC. Lave el pellet celular con 1PBS frío para eliminar los medios restantes, centrífuga a 700 x g, 5 min, 4 oC, y deseche el sobrenadante. Repita este paso una vez.
      4. Células Lyse en tampón de lisis (25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1x cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa) durante 10 minutos sobre hielo, centrífuga a 320 x g durante 10 min, 4 oC. Cosecha sobrenadante y determina la concentración de proteínas mediante un ensayo de proteína de ácido bicincino (ensayo BCA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      5. Proteínas de desnaturalidad (15–30 g/muestra) con 1 tampón de carga SUD (5% 2-mercaptoetanol) y hierve 10 min, 75 oC.
    2. SDS-PAGE
      1. Corregir sándwich de gel con un gel de separación al 10% [4 mL 3x tampón de gel (3 M Tris/HCl, 0,3% (p/v) dodecilo sódico (SDS), pH 8,45), 4 ml de acrilamida 30%, 2,52 ml de glicerol 50%, 1,395 ml de Ah 2 O, 75 ol 11% persulfato de amonio (APS) y 9,75 ml de glicerol 50%, 1,395 ml de Ah2O, 75 ol 11% persulfato de amonio (APS) y 9,75 ol de gel TEMED] y un gel de apilamiento del 4% [1.992 mL 3x tampón de gel, 0,792 ml 30% acrilamida, 3,168 ml H2O, 36 l 11% APS y 6 L de TEMED] en una unidad de ensamblaje de electrodos. Retire los peines, enjuague los pozos con tampón de cátodo (100 mM Tris/HCl, tricine de 100 mM, 0,1% (p/v) SDS) y cargue muestras.
      2. Llene el búfer de ánodo (100 mM Tris/HCl, pH 8.9) en el tanque. Cargue la muestra de proteína del paso 2.1.1.4 y ejecute SDS-PAGE a 70 V, 20 min, seguido de 115 V, 150 min a tensión constante.
    3. Inmunoblotting y detección de CRBN, IKZF1 e IKZF3
      1. Activar la membrana PVDF (0,45 m) en 100% de metanol durante 1 min. Membrana de equilibración y gel de separación en tampón de transferencia 1x [10x tampón de transferencia (192 mM de glicina, 25 mM Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8.3].
      2. Montar casete de hinchado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Gel de transferencia a 180 mA durante 90 min.
      3. Membrana de lavado 3x en 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6, 0.1% Tween 20) durante 5-10 min cada uno a temperatura ambiente. Bloquear la membrana en leche sin grasa del 5% (NFDM), TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Lave la membrana 3x en 1X TBS-T durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente.
      4. Membrana de incubación con anticuerpo primario para CRBN (1:500 en 5% BSA, TBS-T) con agitación suave a 4oC, durante la noche.
      5. Lave la membrana 3x en 1X TBS-T durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente. Membrana de incubación con anticuerpo antiratón (1:10.000 en 5% NFDM, TBS-T) o anticonejo (1:5.000 en 5% NFDM, TBS-T) anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante HRP (1 h a temperatura ambiente.)
      6. Lave la membrana 2x en 1X TBS-T durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente. Repita este paso dos veces con 1 x TBS.
      7. Membrana de incubación durante 2 min con solución de sustrato hrP según los protocolos del fabricante y detectar quimioluminiscencia en un dispositivo de detección de quimioluminiscencia.
      8. Lave la membrana 1x en 1X TBS durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente. Para la liberación de anticuerpos, membrana de tira en tampón de desmontaje disponible en el mismo, durante 15 min.
      9. Rebloquear la membrana en 5% de leche sin grasa, TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Lave la membrana 3x en 1x TBS-T durante 5-10 min cada una a temperatura ambiente y vuelva a sondear con IKZF1, IKZF3 o tubulina según el paso 2.1.3.4.
  2. Experimentos de competición con MG132, MLN4942 o pomalidomida
    NOTA: Para confirmar si crBN se degrada a través de la vía ubiquitina-proteosoma, realizamos experimentos de competencia con el inhibidor del proteasoma MG132 y un inhibidor de la enzima activadora de neddilación (NAE) MLN4942 (Figura 7).
    1. Semilla 1 x 106 células MM1S por pozo en una placa de 6 pocillos. Células de prenderide con MG132 de 10 m, 10 M MLN4942, o lenalidomida (100x), e incubar 1 h a 37 oC, 5% CO2.
    2. Añadir compuesto de 100 nM 8 para 3 h a 37 oC, 5% CO2.
    3. Cosecha de células para la mancha occidental según el paso 2.1.1.
  3. Ensayos de viabilidad celular en múltiples líneas celulares de mieloma
    NOTA: Este ensayo se utiliza para probar el impacto en la viabilidad celular y, además, antagonizar el efecto de los IMID en las células de mieloma múltiple mediante el pretratamiento de las células con compuesto 8 (Figura8, Figura 9A, B).
    1. Semilla5 x 104 MM1S células por pozo en una placa de 96 pocillos en triplicados biológicos para ensayo de viabilidad. Para el análisis de manchas occidentales, semilla 1 x 106 células MM1S por pozo en una placa de 6 pocillos en triplicados biológicos.
    2. Tratar las células con DMSO o 100 nM, 1 m o compuesto de 10 M 8, compuesto 9 o pomalidomida e incubar durante 24 h, 48 h, o 96 h a 37 oC, 5% CO2. Para los experimentos de rescate, trate las células con el compuesto de 100 nM 8 durante 3 h, antes o después de la adición de 1 m de pomalidomida e incubar durante 96 h.
    3. Mida la luminiscencia de la placa de 96 pocillos con un ensayo de viabilidad celular luminiscente, de acuerdo con el protocolo del fabricante en un lector de placas o células de cosecha de la placa de 6 pocillos para el análisis de manchas occidentales.

Resultados

Aquí describimos el diseño, síntesis y evaluación biológica de un PROTAC homodimérico basado en pomalidomida para la degradación de CRBN. Nuestro PROTAC interactúa simultáneamente con dos moléculas CRBN y forma complejos ternarios que inducen la autoubiquitinación y la degradación proteasomal de CRBN con sólo efectos mínimos restantes sobre neo-sustratos inducidos por pomalidomida IKZF1 o IKZF3.

De una serie de mol...

Discusión

El diseño de tales homo-PROTAC como se describe aquí para CRBN se basa en la afinidad específica de la pomalidomida con CRBN, que se ha utilizado con éxito en numerosos PROTAC heterobifuncionales y dio lugar al desarrollo de PROTAC 8 como un altamente degradador selectivo de CRBN. La especificidad de nuestra molécula ya ha sido confirmada por los análisis proteómicos24. Para el knockout genéticamente mediado, la exclusión y validación de los efectos secundarios es difíc...

Divulgaciones

Los autores no declaran un posible conflicto financiero de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 y SFB-1074 a J.K.; FOR2372 a M.G.)

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1'-CarbonyldiimidazoleTCI chemicalsC0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)Sigma-Aldrich385506Compound 6
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 %Alfa AesarA12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 %Acros148270250Toxic
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABCell signaling15103S
Anti-CRBN antibody produced in rabbitSigmaHPA045910
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibodySigma7074S
Ammonium PersulfateRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI chemicalsB1649
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability AssayPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, anhydrous, 99.8 %Acros348435000Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 %Acros348445000Extra Dry over Molecular Sieve
GlycineSigma-Aldrich15523-1L-R
Goat anti-mouse (HRP conjugated)Santa Cruz biotechnologysc-2005
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) MabCell signaling14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm)MerckIPVH000010
Iodomethane, 99 %Sigma-AldrichI8507Highly toxic
MethanolSigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cellBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellBio-Rad1658004
MLN4942biomol (cayman)Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512)SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 %Alfa AesarA11801
Nonfat dried milk powderPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene PlateThermo Scientific136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Protein Assay kitThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
sodium dodecyl sulfateCarl Roth183.1
Sodium ChlorideSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDCarl Roth2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamateSigma-Aldrich89761Compound 5
TricinCarl Roth6977.4
Trizma baseSigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL sprayAdvanstaK-12049-D50

Referencias

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  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
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  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
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  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
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