Uso de um acelerador linear para realização de experimentos de radiobiologia in vitro

Resumo

Aceleradores lineares clínicos podem ser usados para determinar os efeitos biológicos de uma ampla gama de taxas de dose em células cancerosas. Nós discutimos como estabelecer um acelerador linear para os ensaios e os ensaios Cell-Based para o cancro Stem-como as pilhas crescidas como tumorspheres na suspensão e nas linhas de pilha crescidas como culturas aderentes.

Resumo

A radioterapia continua sendo uma das pedras angulares do manejo do câncer. Para a maioria de cancros, é a terapia a mais eficaz, Nonsurgical aos tumores do resseca. Aqui, descrevemos um método para irradiar células cancerosas com um acelerador linear. O avanço da tecnologia de acelerador linear melhorou a precisão e eficiência da radioterapia. Os efeitos biológicos de uma ampla gama de doses de radiação e taxas de dose continuam a ser uma área intensa de investigação. O uso de aceleradores lineares pode facilitar esses estudos usando doses clinicamente relevantes e taxas de dose.

Introdução

A radioterapia é um tratamento efetivo para muitos tipos de câncer^1,2,3,4. A irradiação da taxa de dose elevada extra é relativamente nova na terapia de radiação e é feita possível por avanços tecnológicos recentes em aceleradores lineares⁵. As vantagens clínicas da taxa de dose extra elevada sobre a irradiação padrão da taxa de dose incluem o tempo encurtado do tratamento e a experiência paciente melhorada. Aceleradores lineares também fornecem um cenário clínico para estudos de biologia de radiação baseada em cultura celular. As implicações biológicas e terapêuticas da dose de radiação e das taxas de dose têm sido foco de interesse de oncologistas e biólogos por^{décadas 6,}7,8. Mas, a radiobiologia da irradiação extra elevada da taxa de dose e da irradiação instantânea-uma taxa de dose extremamente elevada de radiação-tem que ainda ser investigada completamente.

A irradiação de raios gama é amplamente utilizada na biologia da radiação baseada na cultura celular^9,10,11. A radiação é alcançada por raios gama emitidos a partir de fontes de isótopos radioactivos em decomposição, tipicamente césio-137. O uso de fontes radioativas é altamente regulado e muitas vezes restrito. Com irradiação baseada em fonte, é desafiador testar uma ampla gama de taxas de dose, limitando sua utilidade na análise dos efeitos biológicos das taxas de dose realizáveis clínicas¹².

Existem vários estudos que ilustram os efeitos da dose e da taxa de dose^{12,13,14,15,16,17}. Nesses estudos, foi utilizada a irradiação gama gerada a partir de isótopos radioativos ou raios-X gerados a partir de aceleradores lineares. Uma variedade de linhas de pilha que representam o cancro de pulmão, o cancro cervical, o glioblastoma, e o melanoma foram usados. Efeitos de radiação na sobrevida celular, parada do ciclo celular, apoptose e dano de DNA foram avaliados como leituras¹²,^{13,14,15,16,17} . Aqui, nós descrevemos um método para definir os efeitos biológicos de doses de radiação clinicamente relevantes e taxas de dose através da entrega de radiação baseada em raios-X usando um acelerador linear. Estes estudos devem ser realizados com estreita colaboração entre o biólogo, oncologista de radiação e físico médico.

Protocolo

1. preparação da pilha para a cultura da pilha da suspensão

1. Glioma da cultura Stem-como pilhas em meios de cultura da pilha de haste em aproximadamente 5 x 10⁶ placas da pilha/10 cm em uma incubadora da cultura de pilha com 5% co₂, umidade relativa de 95% em 37 ° c.
   Observação: a condição de cultura de célula é a mesma em todos os procedimentos. A mídia usada no protocolo são mídia completa.
2. Dois dias antes da irradiação programada, colete a glioma haste-como pilhas da placa da cultura com uma pipeta estéril de 5 mL em um tubo de centrifugação de 15 mL em uma capa da cultura.
3. Centrifugue as pilhas coletadas em 200 x g por 3 minutos em um centrifugador da bancada.
4. Descarte o sobrenadante e digerir o pellet celular (cerca de 1 x 10⁷ células) com 1 ml de tripsina-EDTA à temperatura ambiente por 5 minutos para fazer uma única célula de suspensão em tripsina-EDTA. Agitar suavemente a parte inferior do tubo de centrifugação a cada 2 minutos durante a digestão para se certificar de que as células são digeridas completamente.
5. Adicione 3 mL de mídia de cultura de células-tronco (veja a tabela de materiais) para saciar a tripsina. Centrifugue as células coletadas em 200 x g por 3 min em uma centrífuga de bancada. Descarte o sobrenadante e salve o pellet celular.
6. Ressuscite as células com 5 mL de meios de cultura celular e contar as células com um Hemocytometer.
7. Placa 5 x 10⁶ células em placas de 2 10 cm contendo 10 ml de meios de cultura celular.
8. Logo antes da irradiação programada, recolher as células e descartar o sobrenadante após a centrifugação, conforme descrito na etapa 1,3. Re-suspender o pellet celular com 5 mL de mídia de cultura celular. Transfira 1 mL de suspensão celular para uma placa de 35 mm contendo 2 mL de meios de cultura celular.
   Nota: o volume total de suportes é de 3 mL na placa de 35 mm para tornar o líquido 1 cm de altura na chapa.
9. Transfira as pilhas chapeadas em um recipiente secundário, tal como uma caixa plástica ou da espuma, para reduzir o risco de contaminação e para trazer as pilhas no recipiente à facilidade da irradiação no carro de serviço público.
10. Irradiar as células conforme descrito na etapa 4.

2. preparação da pilha para a cultura de pilha unida

1. Um dia antes da irradiação, na capa da cultura da pilha, remova os meios de DMEM da placa da cultura da pilha da linha de pilha unida, tal como as pilhas de HEK-293. A mídia pode ser aspirada usando uma pipeta Pasteur conectada a um vácuo.
2. Lave as células com 5 mL de PBS estéril para o prato de cultura para enxaguar os meios residuais.
3. Pipeta 1 mL de tripsina-EDTA no prato de cultura e incline suavemente a placa de cultura para se certificar de que todo o prato é coberto com tripsina-EDTA.
4. Trypsinize as pilhas na temperatura ambiente por 5 min. saciar a reação do trypsin-EDTA com 3 mL de meios de DMEM e coletar pilhas com uma pipeta de 5 mL no tubo de centrifugação de 15 mL na capa da cultura.
5. Centrifugue as células coletadas em 200 x g por 3 min em uma centrífuga de bancada. Descarte o sobrenadante e salve o pellet celular.
6. Ressuscite as células com 5 mL de DMEM Media e contar as células com um Hemocytometer.
7. Placa 2 x 10⁵ células em uma placa de 35 mm usando 3 ml de meios de cultura celular a uma altura de 1 cm de mídia.
8. Após 24 h da cultura de pilha na incubadora em 37 ° c, transfira as pilhas chapeadas em um recipiente secundário (isto é, uma caixa isolada da espuma) à facilidade da irradiação em um carro de serviço público.
9. Irradiar células conforme descrito na etapa 4.

3. preparação de células para imunocoloração após irradiação

1. Descongelar a matriz de proteínas extracelulares comerciais no gelo a 4 ° c durante a noite. Pré-Chill 200 μL pontas de pipeta e 1,5 mL tubos de centrifugação a 4 ° c durante a noite.
2. Aliquot matriz de proteínas extracelulares com pontas de pipeta pré-refrigeradas e tubos de centrifugação de 1,5 mL a 200 μL por tubo.
3. Diluir 200 μL de matriz proteica extracelular em 20 mL pré-refrigerados de meios de cultura celular para fazer 1% de mídia de matriz de proteínas extracelulares.
4. Coloque uma lamínula esterilizada (22 mm x 22 mm) numa placa de 35 mm. Coloque 400 μL de meios de matriz de proteínas extracelulares a 1% na lamínula.
5. Coloc a placa de 35 milímetros na incubadora da cultura da pilha em 37 ° c para 1 h para permitir que a matriz extracelular da proteína polimerize no COVERSLIP.
6. Ao usar a cultura de célula de suspensão, faça uma única suspensão de célula, conforme descrito nas etapas 1,1 a 1,5.
7. Placa 5 x 10⁴ células em um lamela matriz-revestido da proteína extracelular coloc em uma placa de 35 milímetros. Retorne pilhas chapeadas à incubadora da cultura de pilha durante a noite para assegurar-se de que as pilhas sejam apoiadas pela matriz da proteína. O volume total da mídia na placa deve ser de 3 mL para fazer a altura da mídia chegar a 1 cm no prato de cultura.
8. Observe as células um microscópio de campo brilhante com lente objetiva de ampliação 10x. As células devem espalhar-se na lamínula em vez de flutuar. Transfira o prato da cultura com as pilhas chapeadas em um recipiente secundário tal como uma caixa da espuma à facilidade da irradiação em um carro de serviço público e irradie as pilhas como descrito em etapa 4.
9. Ao usar culturas de células anexadas (por exemplo, células HEK-293), digerir células conforme descrito nas etapas 2,1 a 2,6. Coloc 5 x 10⁴ pilhas em um deslizamento estéril da tampa em uma placa de 35 milímetros um o dia antes da irradiação para certificar-se que as pilhas estão unidas inteiramente à superfície do lamela observando os um microscópio como na etapa 3,9. Use 3 mL de mídia DMEM para fazer o líquido 1 cm de altura na placa.
10. Após o cultivo de células em coberturas durante a noite ou até um dia, transfira o prato de cultura com células chapeadas em um recipiente secundário para a instalação de irradiação. Um carrinho de serviço pode ser usado para reduzir o risco de derramamento. Irradiar células conforme descrito na etapa 4.

4. irradiação com um acelerador linear (LINAC)

1. Usando o software do console de LINAC, ajuste o pórtico do acelerador e o colimador a 0 °, abra as maxilas de X e de Y a um tamanho simétrico do campo de 20 x 20 cm² e retraia os colimadores da multi-folha (MLCs) se presente.
   Nota: os LINACs podem ter um modo de filtro nivelador livre (FFF), permitindo taxas de dose muito elevadas. Como o nome sugere, esta radiação não é uniforme (plana), e a alta taxa de dose só é alcançada no centro do feixe. Neste caso, é utilizado um campo de 7 x 7 cm² .
2. Coloc pelo menos 5 cm do material equivalente da água no sofá do tratamento. Coloque o prato da pilha a ser irradiado em 400 MU/min (taxa de dose padrão) no material equivalente da água e centrem-no na mira de LINAC.
3. Coloc as pilhas a ser irradiadas em uma profundidade da dose máxima em um feixe de raio X de 6 milivolt, ao redor 1,5 cm. Coloque um adicional de 1 cm de material equivalente de água em cima do prato. Combinado com os 1 cm do meio em todo que as pilhas são suspendidas, esta coloca as pilhas em uma profundidade média de 1,5 cm.
4. Fixe o ponteiro dianteiro à cabeça do LINAC. Estenda o ponteiro dianteiro até que ele entre em contato com a superfície do material de acúmulo e anote a distância. Ajuste a altura da mesa até que a distância entre a fonte e a superfície de acúmulo seja de 100 cm.
   Nota: a distância pode ser confirmada com o indicador óptico de distância. Alternativamente, o indicador ótico da distância pode ser usado no lugar do ponteiro dianteiro para ajustar a fonte à superfície do acúmulo a 100 cm.
5. Calcule o número apropriado de unidades do monitor (MU) para entregar a dose desejada de radiação às pilhas e programe o acelerador para entregar em 400 MU/min.
   Nota: para a fonte à distância de superfície (SSD) setup em um LINAC calibrado para entregar 1 cGy/MU na profundidade da dose máxima, o número exigido de unidades do monitor é calculado usando MU = dose (cGy)/(1 cGy/MU)/de (20x20), onde de carrinhos para o fator de saída. Esse cálculo terá que ser alterado para LINACs usando configurações de calibração alternativas.
6. Deixe o cofre de tratamento e verifique se todos os outros indivíduos foram exited. Vrify que não há outras células na sala, ou eles vão receber baixas doses de radiação. Fecha a porta do cofre.
7. Confirme o tamanho do campo, MU e MU/min no console e, em seguida, ative a viga.
8. Repita os passos 4.3-4.8 para que as células sejam irradiadas a taxas de dose mais elevadas ou inferiores.
   1. Para obter taxas de dose mais elevadas (por exemplo, 2100 MU/min ou superior) com o acelerador, diminua o SSD para aumentar a taxa de dose efetiva para as células de acordo com a lei do quadrado inverso: DoseRateEffective = Doserate * (100 cm/SSD_New)².
   2. Para baixas taxas de dose (por exemplo, 20 MU/min), aumente a fonte à distância de superfície (SSD_New) para diminuir a taxa de dose. Por exemplo, o prato da cultura da pilha pode ser coloc no assoalho da sala de tratamento.
   3. Recalcular a configuração da unidade do monitor no acelerador se esta configuração for necessária, usando MU = dose (cGy)/(1 cGy/MU)/de (20x20)/(100 cm/SSD_New)². Para obter informações adicionais sobre cálculos MU, consulte a referência de McDermott e Orton¹⁸.
9. Determine a taxa de dose em GY/minute por DoseRate (Gy/min) = dose (GY) * (MU/min)/MU. por exemplo, 4 GY entregues em 400 MU/min requer 380 MU, então 4 * 400/380 = 4,2 GY/min. Consulte a tabela 1.

Figura 1 : Set-up do prato da cultura da pilha no acelerador linear. A) é apresentado um acelerador linear clínico. (B) 5 cm de material de água equivalente é colocado no sofá de tratamento. (C) um prato da cultura da pilha é coloc na superfície do material. (D) o prato é centrado usando os mira do acelerador no campo do tratamento mostrado pelo campo claro quadrado. (E) o material equivalente da água de 1 cm é coloc sobre o prato da cultura da pilha. A fonte à distância da superfície (SSD) é verificada usando um indicador ótico da distância (F, G) ou um ponteiro dianteiro (H, I). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. ensaios biológicos após a irradiação

1. Após a irradiação, retorne as células para a incubadora da cultura celular da mesma maneira descrita acima (etapa 1,9, 2,8 e 3,10).
2. Conforme necessário, adaptar uma variedade de ensaios biológicos para caber no projeto de pesquisa.
   Nota: aqui, nós mostramos uma análise representativa do ciclo de pilha¹⁶ como um exemplo de um ensaio biológico depois da irradiação.

Resultados

Para investigar o efeito do ciclo celular da taxa de dose padrão e da irradiação da taxa de dose extra alta por um acelerador linear, três amostras de glioma Stem-como pilhas foram preparadas usando este protocolo e coletadas 24 h após a irradiação¹⁷: uma amostra de controle que não foi irradiada (Figura 2a), uma amostra IRRADIADA com 400 MU/min (unidade monitor, 4,2 GY/min taxa de dose padrão, Figura 2B<...

Discussão

A radioterapia é parte integrante do manejo do câncer. Os esforços contínuos procuram melhorar a eficácia e a eficiência do tratamento de radiação. Os avanços na tecnologia de acelerador linear têm proporcionado a oportunidade de tratar pacientes com precisão e segurança sem precedentes. Como a maioria dos pacientes é tratada com raios-X de alta energia de aceleradores lineares, estudos que examinam os efeitos biológicos de uma grande variedade de taxas de dose executadas em aceleradores lineares podem ser ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
glioma stem-like cell 387			gift from Dr. Jeremy Rich
293 cells	ATCC	CRL-1573
neuron stem cell culture media	Thermo Fisher Scientific	21103049	NeurobasalTM media
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-01M
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	4114-TC-01M
B-27™ Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
Sodium Pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360070
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030164
Tripsin-EDTA	Thermo Fisher	25200056
extracellular proten matrix	Corning	354277	MatrigelTM
Ethanol	Fisher chemical	A4094
Equipment
10 cm cell culture dish	Denville	T1110
3.5 cm cell culture dish	USA Scientific Inc.	CC7682-3340
22x22mm glass cover slip	electron microscopy sciences	72210-10
15 ml centrifuge tube	Thomas Scientific	1159M36
50 ml centrifuge tube	Thomas Scientific	1158R10
5 ml Pipette	Fisher Scientific	14-955-233
pipet aid	Fisher Scientific	13-681-06
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-414
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Linear Accelerator	Varian	n/a
water equivalent material	Sun Nuclear corporation	557	Solid waterTM
Reagent preparation
DMEM media	10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml DMEM media
stem cell culture media	10 ml B27 supplement, 20 µg hFGF, 20 µg hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml Neurobasal media