JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, kemirgen beynin farklı hücresel bölmeler içinde Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS) etkinliğini verimli bir şekilde ölçmek için tasarlanmıştır. Kullanıcılar, aynı hayvanlarda nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonlar içinde çalışan UPS 'i inceleyebilir, bu karmaşık analizleri gerçekleştirmek için gereken zaman ve hayvan sayısını azaltır.

Özet

Ubiquitin-proteasom sistemi, protein bozulması ve ökaryotlar içindeki diğer hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisidir. Beyinde, Ubiquitin-proteasom aktivitesinde artar sinaptik plastisite ve bellek oluşumu için kritik ve bu sistemde anormal değişiklikler nörolojik çeşitli ile ilişkilidir, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluklar. Beyin içinde Ubiquitin-proteasome işleyişi okuyan sorunlardan biri, tüm hücresel bölmeler içinde mevcut olmasıdır, hangi protein hedefleri, fonksiyonel rol ve düzenleme mekanizmaları yaygın olarak değişebilir. Sonuç olarak, aynı hayvan içinde farklı hücre içi bölmeler içinde beyin Ubiquitin protein hedefleme ve proteasom katalitik aktivite doğrudan karşılaştırmak için yeteneği tam olarak nasıl UPS sinaptik plastisite katkıda anlaşılması için önemlidir, bellek ve hastalık. Burada açıklanan yöntem, aynı kemirgen (sıçan) beyinden gelen nükleer, sitoplazmik ve ham sinaptik fraksiyonlar toplamasının ardından, proteasom katalitik aktivitesinin eşzamanlı ölçülmesini (dolaylı olarak, proteasom çekirdeğinin etkinliğini sağlayarak) sağlar Sadece) ve bağlantıya özgü Ubiquitin proteini etiketleme. Böylece, yöntem doğrudan sinaptik plastisite, bellek oluşumu ve farklı hastalık durumları sırasında aynı hayvan farklı beyin bölgelerinde Ubiquitin-proteasome aktivite hücre altı değişiklikleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem, aynı hayvan içindeki diğer proteinlerin alt hücresel dağıtımı ve fonksiyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir.

Giriş

Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS), hücreler1' de en kısa ömürlü proteinlerin bozulmasını kontrol eden birbirine bağlı protein yapıları ve ligazların karmaşık bir ağıdır. Bu sistemde, proteinlerin bozulması veya diğer hücresel süreçler için işaretlenmiş/küçük değiştirici Ubiquitin tarafından kaderleridir. Bir hedef protein, bir önceki Ubiquitin2' de yedi lizin (K) sitelerden (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ve K63) veya N-terminal metiyoninin (M1; doğrusal olarak bilinen) birinde birlikte bağlanabilen 1-7 Ubiquitin modifikasyonları elde edebilir. Bu polyubiquitin etiketleri bazıları bozulmaya özeldir (K48)3, diğerleri büyük ölçüde protein bozulması süreci bağımsız iken (M1)4,5,6. Böylece, protein mayası süreci inanılmaz karmaşık ve belirli bir polyubiquitin etiketi değişiklikleri ölçmek için yeteneği sonuçta hücresel işleyişinde verilen değişikliğin rolünü anlamak için önemlidir. Bu sistemin çalışmayı daha da zorlaştıran, UPS7' nin katalitik yapısı olan proteasom, her iki proteini de düşürür, ancak diğer proteolitik olmayan süreçlerde de yer alabilir8,9. Daha sonra, ilk keşfi, normal ve anormal Ubiquitin-proteasom aktivitesi uzun süreli bellek oluşumu ve birçok nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar Devletler, karışmıştır beri şaşırtıcı değil bozukluklar10,11. Sonuç olarak, beyindeki UPS aktivitesini etkili ve verimli bir şekilde ölçen Yöntemler, sonuçta bu sistemin hastalık Devletlerinde nasıl disdüzenli olduğunu ve Ubiquitin ve/veya hedef alan tedavi seçeneklerinin nihai gelişimini anlamak için önemlidir proteasom işleyişi.

1) Ubiquitin modifikasyonları çeşitliliği ve 2) dağılımı dahil olmak üzere, UPS fonksiyonunu incelemek için kullanılan en yaygın model sistemleri olan fareler ve farelerden gelen beyin dokusunda Ubiquitin-proteasom aktivitesinin ölçüldiği bir dizi sorun vardır. UPS 'in hücre içi bölmeler arasında işleyişi diferansiyel Yönetmeliği12,13,14. Örneğin, bellek oluşumu sırasında beyinde Ubiquitin-proteasom fonksiyonunun erken gösterilerinin çoğu, her iki protein mayası ve proteozom aktivitesinde zaman bağımlı artışları ve belirtilen tüm hücre endoglikozidazları kullanılır15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. ancak, son zamanlarda bu Ubiquitin-proteasome aktivite yaygın olarak öğrenme yanıt olarak alt hücre bölmeleri arasında çeşitli bulundu, bazı bölgelerde eşzamanlı artışlarla ve diğerlerinden azalır, önemli ölçüde farklıdır bir desen daha önce tüm hücre endoglikozidazları21bildirildi. Bu, tüm hücre yaklaşımlarının sınırlandırılmasıdır, çünkü bu, UPS aktivitesindeki değişikliklerin farklı alt hücresel bölmeler boyunca katkılarını ayıramaz. Yine de daha yeni çalışmalar araştırmada sinapses özellikle de UPS çalışmak için sinaptik kesir protokolleri istihdam var22,23,24, yöntemleri ölçmek için occlude kullanılan yöntemler aynı hayvanda nükleer ve sitoplazmik Ubiquitin-proteasom değişiklikleri. Bu, her biri farklı bir hücre altı fraksiyonu toplama, deneyler birden çok kez tekrarlamak için gereksiz bir ihtiyaç sonuçlanır. Bu, sadece hayvan hayatlarını daha büyük bir kayıpla sonuçlanır, ancak belirli bir olaya veya belirli bir hastalık durumunda yanıt olarak farklı hücre içi bölmeler arasında UPS etkinliğini doğrudan karşılaştırmak için yeteneğini ortadan kaldırır. Ubiquitin ve proteasomun protein hedeflerini göz önünde bulundurarak hücre boyunca yaygın olarak farklılık gösterir, nasıl Ubiquitin-proteozom sinyalizasyon farklı alt hücre bölmeler farklıdır anlamak UPS işlevsel rolünü belirlemek için önemlidir beyin bellek oluşumu ve nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluklar sırasında.

Bu gereksinimi ele almak için, Geçenlerde aynı hayvan21gelen belirli bir beyin bölgesi için nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonları toplanan olabilir bir prosedür geliştirdik. Ayrıca, aynı örnekten birden fazla hücre altı fraksiyonları toplama elde edilebilir protein sınırlı miktarda hesaba, biz tahlil in vitro proteozom aktivite ve bağlantı spesifik için önceden kurulan protokolleri optimize kemirgen beyin dokusundan toplanan lysed hücrelerinde protein mayası. Bu protokolü kullanarak, biz toplamak ve doğrudan proteasom aktivite, K48, K63, M1 ve Atom ve sitoplazmada genel protein polyubiquitination düzeylerinde öğrenme bağımlı değişiklikleri karşılaştırmak başardık ve fareler lateral amigdala sinaps. Burada, UPS 'in uzun süreli bellek oluşumu ve çeşitli hastalık Devletlerinde nasıl yer aldığı konusunda anlayışımızı önemli ölçüde iyileştiren prosedürlerimizi ayrıntılı olarak tarif ediyoruz (Şekil 1). Ancak, bizim protokolde tartışılan in vitro proteasom aktivite, yaygın olarak kullanıldığında, doğrudan tam 26S proteozom kompleksleri aktivitesini ölçmek değil unutulmamalıdır. Yerine, bu tahlil 20s çekirdek etkinliğini ölçer, sadece bir vekil olarak tüm 26S proteozom kompleks aksine çekirdek kendisi etkinliğini anlamak için hizmet edebilir anlamına gelir.

Protokol

Hayvan konuları da dahil olmak üzere tüm prosedürler Virginia Politeknik Enstitüsü ve Devlet Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.

1. kemirgen beyin dokusu toplama ve diseksiyon

Not: Bu protokol çeşitli beyin bölgelerine uygulanabilir ve çeşitli doku toplama prosedürleri ile kullanılabilir. Aşağıda 8-9 hafta eski erkek Sprague Dawley fareler kullanarak, sıçan beyin dokusu hücre altı için laboratuvarımızda kullanılan prosedürdür. Aynı hayvanın tüm hücresel bölmeler işlemek için, Bölüm 1,3. kullanılan doku toplama prosedürü ne olursa olsun takip edilmelidir.

  1. Sıçan beyni ayıklamak ve kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş bir kriyojenik fincan içine yer. Flaş-Kuru buz üzerinde beyin dondurmak, ya da varsa sıvı nitrojen kullanın ve a-80 °C derin dondurucu transfer. Beyin aynı gün veya daha sonraki bir zamanda disseke olabilir.
  2. Dondurulmuş beyin kriyojenik fincan ve yerden Kuru buz ile soğutulmuş bir sıçan beyin matrisine çıkarın. Matrisdeki her yuva, faiz bölgesinin (YG) yaklaşık konumunu belirlemek için kullanılabilecek 0,5 mm 'ye karşılık gelir.
    1. Bir sıçan beyin Atlası kullanarak, bir jilet içine hemen ön (ön) ROı ve tahmin başlangıcı Daha sonra, YG 'nin öngörülen ucunda (posterior) hemen bir jilet takın.
    2. Bir neşter kullanarak jilet bıçakları arasındaki dilimi çıkarın ve kuru buz üzerinde soğutulmuş bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin. Genellikle, bölümler 2-3 mm kalınlığında ancak bu YG 'ye göre değişir.
  3. Bir neşter kullanarak, bir defada bir yarımküre YG dışarı çıkarın. Her Yarımküre ayrı 1,5 mL mikrosantrifüjli tüpler Kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş yerleştirin. Dondurulmuş doku,-80 °C ' de saklandığı takdirde, hemen alt hücreli fraksiyonlama veya daha sonra işlenmiş olarak kullanılabilir.

2. nükleer ve sitoplazmik ekstraksiyon

Not: Bu protokol, 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 m dithiothreitol (DTT), 0,5 m ethylenediaminetetraasetic ASIT (EDTA), 5 m NaCl,% 10 NP-40 (IGEPAL) ve% 50 gliserol dahil olmak üzere ortak Laboratuar Kimyasalları premade stok çözümleri kullanır. Eğer uç nokta proteasom aktivite sürecinde kullanılırsa, lizol sırasında proteasom kompleksler demontaj önlemeye yardımcı olmak için tüm tamponlara gliserol ve ATP eklenebilir.

  1. Lysis arabelleğini hazırlayın. Steril 15 ml konik tüp için ultra saf (deiyonize ve distile) su 8,63 ml ekleyin.
    1. Konik tüp için 1.000 μL 0,1 M HEPES, 15 μL 1 M MgCl, 100 μL 1 M DTT ve 50 μL% 10 NP-40 ekleyin.
    2. 100 μL proteaz inhibitörü kokteyli ve 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyli ekleyin. Kısaca mix ve chill ıslak buz üzerine yerleştirmek için çözüm Vortex. Çözelti fosfataz inhibitörü sarı bir renk tonu olabilir unutmayın.
      Not: Proteaz inhibitörlerinin kullanımı protein korumak ve in vitro proteozom aktivite tahlil özgüllüğü sağlamak için esastır. Ancak, bu inhibitörler de proteasom aktivite hafif bir azalma neden olabilir, aktivite in vitro tahlil üzerinde ölçülen gerçek aktivite düzeylerinin bir hafife olabilir anlamı.
  2. Ayıklama arabelleği hazırlayın. Steril 15 ml konik tüp için ultra saf (deiyonize ve distile) su 5,925 ml ekleyin.
    1. Konik tüp için 2.000 μL 0,1 M HEPES, 1250 μL% 50 gliserol, 15 μL 1 M MgCl2, 5 μL 1 m DTT, 5 μl, 0,5 m EDTA ve 600 μL 5 m NaCl ekleyin.
    2. 100 μL proteaz inhibitörü kokteyli ve 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyli ekleyin. Kısaca mix ve chill ıslak buz üzerine yerleştirmek için çözüm Vortex. Çözelti fosfataz inhibitörü sarı bir renk tonu olabilir unutmayın.
  3. 1,5 mL santrifüj mikrotüpünü-80 °C dondurucudan YG 'nin bir yarımküre içeren çıkarın. Kullanılan Yarımküre her deneysel grup için ekstraksiyon koşulları arasında karşı dengeli emin olun. Örneğin, iki grup denemede, her grupta ilk iki hayvan için sol Yarımküre ve sonraki iki numune için sağ Yarımküre vb. kullanın.
  4. Bir neşter kullanarak, dondurulmuş beyin dokusu Transfer 2 mL Cam Teflon Homogenizer. Teflon tüpüne 500 μL Lysis tampon ekleyin.
    1. Havaneli B kullanarak, aynı dokuyu, hiçbir görünür miktarda katı malzeme buluncaya kadar 15 vuruş kullanarak homojenleştirin. Her kontur sırasında bir dönüm hareketi (saat yönünde veya saat yönünde) kullanın.
  5. 1.000 bir μL pipet kullanarak homojenize numuneyi yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüp ıslak buz üzerine yerleştirin ve 30 dakika boyunca inkübe.
  6. 845 x g ve 4 °c ' de 10 dakika boyunca mikrosantrifüjte boru yerleştirin ve döndürün. Tamamlandıktan sonra, dikkatli pipetleme ve yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüjü tüp içine yerine süpernatant çıkarın; Bu sitoplazmik kesir, buzda depolanabilir ya da 4 °C ' ye kadar Bölüm 2,9.
  7. 50 μL ekstraksiyon arabelleği elde edilen Pelet ve pelletini pipetleme ile ekleyin. Pellet girdap yapmayın. Buz üzerine resuspended Pelet içeren tüp yerleştirin ve 30 dakika boyunca inküye.
  8. Tüp mikrosantrifüjte yerleştirin ve 21.456 x g, 4 °c ' de 20 dakika döndürün. Tamamlandıktan sonra, dikkatli pipetleme ve yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüjü tüp içine yerine süpernatant çıkarın; Bu nükleer kesir. Pelet artık atılabilir.
  9. Ölçüm protein konsantrasyonu sitoplazmik ve nükleer ekstraksiyonları DC protein tahlil kullanarak (üreticinin talimatlarına göre), veya numuneler için herhangi bir eşdeğer tahlil olmayan-iyonik deterjanlar kullanılarak toplanan. Hemen proteasom aktivite tahlil (Bölüm 4) veya Batı Blot (Bölüm 5) devam edin. Alternatif olarak, örnekler gerekli olana kadar-80 °C ' de depolanabilir.

3. Synaptic kesir koleksiyonu

Not: Bu protokol, 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl ve% 10 SDS dahil olmak üzere ortak laboratuar kimyasallarının önceden üretilmiş stok çözümlerini kullanır. Eğer uç nokta proteasom aktivitesinde kullanılırsa, lizol sırasında proteasom kompleksler demontaj önlemeye yardımcı olmak için tüm tamponlara gliserol ve ATP eklenebilir

  1. 320 mM sucrose ile TEVP arabelleği hazırlayın. 60 ml Ultra saf (deiyonize ve distile) su temiz 100 ml Beaker ekleyin.
    1. Beaker, eklemek 1.300 μL 1 M Tris (pH 7,5), 260 μL, 0,5 M EDTA, 100 μL proteaz inhibitör kokteyl, 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyl ve 10,944 g sakaroz. Sakaroz tamamen çözülene kadar bir karıştırın Bar ile karıştırın.
    2. Bir pipet kullanarak solüsyona hidroklorik asit (HCl) dropwise ekleyerek pH ~ 7,4 getirin.
    3. Solüsyonu 100 mL Volumetrik Flask 'e aktarın. Ultra saf su ekleyerek 100 ml 'ye hacim getirin. Buzun üzerindeki son solüsyonu gerekli olana kadar rahatlayın.
  2. Homojenizasyon tamponunu hazırlayın. 60 ml Ultra saf (deiyonize ve distile) su temiz 100 ml Beaker ekleyin.
    1. 1 M Tris (pH 7,5), 3.000 μL 5 M NaCl, 100 μL proteaz inhibitörü kokteyli, 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyli ve 2.000 μL% 10 SDS 5.000 μL ekleyin. Bir karıştırın Bar ile karıştırın.
      Not: İyonik deterjanlar, proteasom kompleksinin denatlaşmasına neden olan proteasom aktivitesine müdahale edebilir. İstenirse, proteasom fonksiyonunu korumaya yardımcı olmak için SDS hacmi azaltılabilir.
    2. Bir pipet kullanarak çözüme HCl dropwise ekleyerek ~ 7,4 pH getirin.
    3. Solüsyonu 100 mL Volumetrik Flask 'e aktarın. Ultra saf su ekleyerek hacmi 100 ml 'ye getirin. Son çözümü oda sıcaklığında saklayın; SDS çözeltinin dışına çökecek gibi Chill etmeyin.
  3. 1,5 mL Santrifüjü-80 °C dondurucudan YG 'nin bir yarımküünü içeren çıkarın. Kullanılan Yarımküre her deneysel grup için ekstraksiyon koşulları arasında karşı dengeli emin olun. Örneğin, iki grup denemede, her grupta ilk iki hayvan için sol Yarımküre ve sonraki iki numune için sağ Yarımküre vb. kullanın.
  4. Bir neşter kullanarak, dondurulmuş beyin dokusu Transfer 2 mL Cam Teflon Homogenizer. Teflon tüpüne 500 μL TEVP tampon ekleyin.
    1. Havaneli B kullanarak, katı malzemenin hiçbir görünür transferleri mevcut kadar 15 vuruş kullanarak aynı doku homojenize. Her kontur sırasında bir dönüm hareketi (saat yönünde veya saat yönünde) kullanın.
  5. 1.000 bir μL pipet kullanarak homojenize numuneyi yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dk, 4 °C için 1.000 x g 'de santrifüjün.
  6. Süpernatant toplayın ve bir 1.000 μL pipet kullanarak yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüjü tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dk, 4 °C için 10.000 x g 'de santrifüjün. Orijinal Pelet (P1) çekirdekleri ve büyük enkaz içerir ve atılabilir.
  7. Süpernatant yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüp aktarın. Bu bir Sitosolik kesir. 50 μL homojenizasyon arabelleği Pelet (P2) ekleyin ve hiçbir katı malzeme görünür olana kadar pipetleme ile pelletini.
  8. Numuneyi 10 dk, 4 °C için 20.000 x g 'de santrifüjün. Süpernatant yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüp aktarmak; Bu ham Synaptosomal membran (Synaptic) kesir. Pelet atılabilir.
  9. Ölçmek sinaptik fraksiyonunun protein konsantrasyonu DC protein tahlil kullanarak (üreticinin talimatlarına göre), ya da numuneler için herhangi bir eşdeğer tahlil iyonik deterjanlar kullanılarak toplanan. Hemen proteasom aktivite tahlil (Bölüm 4) veya Batı Blot (Bölüm 5) devam edin. Alternatif olarak, örnekler gerekli olana kadar-80 °C ' de depolanabilir.

4. proteasome aktivite tahlil

Not: Proteasom aktivitesi, 20S proteasome Activity Kit 'in biraz değiştirilmiş versiyonunu kullanarak homojenize beyin dokusunda ölçülebilir. Bu tahlil doğrudan tam 26S proteozom kompleksleri etkinliğini ölçmez. Yerine, bu 20s çekirdek etkinliğini ölçer, sadece bir vekil olarak tüm 26S proteozom kompleks aksine çekirdek kendisi etkinliğini anlamak için hizmet edebilir anlamına gelir. Bu testin başarısı tekrarlayan donma-çözme döngüleri ve/veya deterjanlar, özellikle iyonik artan seviyeleri ile düşüş ve bir 360/460 ile bir plaka okuyucu kullanımı gerektirir (uyarma/emisyon) filtre seti ve Isıtma yetenekleri kadar 37 °C.

  1. Plaka okuyucu ayarları: 37 °C ' ye kadar önceden ısınır ve koşudan tutun.
    1. 360 ve emisyon 460 için uyarma ayarlayın. 96 iyi plaka kullanıldığında açık ise, optik konumu altolarak ayarlayın. Koyu/siyah 96 iyi plaka kullanılırsa, optik pozisyon üstayarlayın.
    2. Floresan okuma seçenekleri altında Auto-Gain için eski plaka okuyucu modelleri ayarlayın; Yeni modeller bunun için önceden ayarlanmıştır. Program 2 h bir zaman ile kinetik bir çalışma, tarama (okuma) her 30 dakika.
  2. 13,5 ml Ultra saf su ile kit içinde sağlanan 10X tahlil tamponu yeniden oluşturur. Şimdi 1x tampona 14 μL 100 mM ATP ekleyin; Bu önemli ölçüde numunelerde proteasom etkinliğini artırır ve tahlil güvenilirliğini artırır. Son 20S assay tamponu buzda veya 4 °C ' de gerekene kadar saklanabilir ve birkaç ay boyunca kararlı olur.
  3. 100 μL DMSO ile kit içinde sağlanan ayc standardını yeniden oluşturur. Standart ışık hassasiyetli olduğu için bu adımı karanlıkta veya düşük ışık koşullarında gerçekleştirin.
  4. Reconstituted standart, karanlıkta veya düşük ışık koşullarında kullanarak bir stand eğrisi oluşturma.
    1. Ayrı 0,5 mL mikrosantrifüjli tüplerde, 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,8 ve 0 μM ABC konsantrasyonuna karşılık gelen, 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,4, 0,5 ve 0 μL ayc standardını ekleyin.
    2. Bu tüpler için, aynı sırada, eklemek 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 ve 100 μL 20S assay tampon. Bu, homojen numunelerde plaka okuyucu kalibrasyonu ve proteasom aktivitesinin analizi için kullanılacak yüksek düşük ayc konsantrasyonlarına sahip bir dizi oluşturur.
    3. Gerektiğinde tüm seyreltilmiş standartları karanlıkta buzda saklayın.
  5. 65 μL DMSO ile kit içinde sağlanan proteasom substrat (suc-LLVY-ayc) yeniden oluşturur. Bu adımı karanlıkta veya düşük ışık koşullarında, substrat ışık hassasiyetli olarak gerçekleştirin. 20 ' lik assay tampon kullanarak yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüjli tüpte proteasom substrat bir 1:20 seyreltme oluşturun. Seyreltilmiş substrat gerektiğinde karanlıkta buzun üzerinde saklayın.
    Not: Örneğin, plaka 10 numune ve 1 boş olursa, 10 μL 'de de 22 kuyu (çoğaltır) için yeterli seyreltilmiş substrat gerekir. Bu 220 μL 'ye eşittir, pipetleme hataları için + 30 μL gerekir, 12,5 μL substrat ve 237,5 μL 20s assay tampon gerektirir.
  6. İstenilen numuneleri (dondurulmuş ise) çözün ve 96 iyi plakaya normalleştirilmiş bir miktar ekleyin. Her örneği yinelemeler içinde çalıştırın. Gerekli numune miktarı doku preparine göre değişir. Genellikle, 10-20 μg herhangi bir hücre altı fraksiyonu için yeterlidir.
  7. Örnek kuyu hacmini Ultra Saf suyla 80 μL 'ye getirin. Eklenen miktar, eklenen örnek hacmine bağlıdır. Örneğin, örnek 1 4,5 μL protein ve örnek 2 ise 8,7 μL ise, gerekli su miktarı sırasıyla 75,5 μL ve 71,3 μL olacaktır. İki ayrı kuyunda, tek başına 80 μL su ekleyin; Bu tahlil boşluklar olacaktır.
    Not: Pipetleme hataları nedeniyle protein hacminde yapılan değişiklikleri sınırlamak için, protein konsantrasyonları en az konsantre numunenin normalleştirilebilir. Bu, tüm koşullarda aynı örnek birimin kullanımına izin verir.
  8. Her iyi, assay boşluklar da dahil olmak üzere 20S assay tampon 10 μL ekleyin. Bir Repeater/otomatik pipet kuyular arasında tutarlı tahlil hacmi sağlamak için burada tavsiye edilir.
  9. Isteğe bağlı: Bu aşamada istenirse in vitro manipülasyonları tanıtın; Bu, her numunenin araç dahil olmak üzere tedavi başına ek 2 kuyuları olmasını gerektirecektir. Eğer öyleyse, ekleyin 5-10 μL ilaç/bileşik faiz 2 örnek kuyuları ve bir eşdeğer hacim kontrol/araç için başka bir 2 kuyu. Plakayı önceden ısıtılmış plaka okuyucuya veya 37 °C ' ye 30 dakika süreyle inküvatörün üzerine yerleştirin.
  10. Işıkları kapatın veya karanlık bir oda girin. Tüm 100 μL seyreltilmiş ayc standartlarını yeni bir kuyulara ekleyin; her standart tek bir kuyu olacak.
  11. Karanlıkta, numune ve tahlil boşlukları içeren kuyulara 10 μL seyreltilmiş proteasom substrat ekleyin, ancak ayc standardına değil. Bir Repeater/otomatik pipet kuyular arasında tutarlı tahlil hacmi sağlamak için burada tavsiye edilir.
  12. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve kinetik koşuya başlayın.
    Not: Plaka kinetik koşmak sırasında sürekli ajitasyon altında olması gerekmez, ancak, Kullanıcı isterseniz seçebilirsiniz
  13. Kinetik çalışma sonunda, RAW 360/460 floresan değerleri Microsoft Excel 'e dışa aktarın.
    1. Ortalama birlikte her standart, her örnek ve tüm 5 taramaları için tahlil Blank için yinelenen kuyular. RAW floresan değerleri numuneler için taramalar arasında artmalıdır ancak standartlar ve tahlil boşlukları için istikrarlı (veya biraz azalma) kalır.
    2. En yüksek ayc standart iyi ortalamasını alın ve bilinen konsantrasyon (20 μM) ile Böl. Standartlaştırılmış değeri almak için tahlil kullanılan örnek konsantrasyon tarafından bu değeri bölmek. Her örnek ve assay boş ortalama için, standartlaştırılmış ayc değerine göre Böl.
    3. Bu son değeri alın ve her örnek ve tahlil Blank için normalleştirilmiş değeri elde etmek için tahlil kullanılan örnek konsantrasyon tarafından bölmek. Tüm 5 taramaları için bunu yapın.
    4. Normalleştirilmiş assay boş değeri her normalleştirilmiş örnek değeri tüm 5 taramaları için çıkarın.

5. bağlantı-spesifik protein Ubiquitination ölçümü

  1. Kemirgen beyin dokusundan toplanan farklı hücreli fraksiyonlar içinde çeşitli polyubiquitin etiketlerinin ölçülmesini, benzersiz, bağlantı spesifik polyubiquitin antikorları ile birlikte standart Batı şişme protokolleri çeşitli kullanılarak yapılmalıdır.
    1. Denaturing için, normalleştirilmiş numuneleri, üreticinin talimatı başına, hacim olarak% 5 oranında β-mercaptoetanol ile tamamlayıcı olan Laemmli numune tamponunun eşit hacmine sahip olarak karıştırın.
    2. Bağlantı ne olursa olsun tüm monoubiquitination ve polyubiquitination modifikasyonları için bir Pan-Ubiquitin antikor kullanın.
    3. Tüm polyubiquitinated proteinleri tanımak için, monoubiquitination ile çapraz reaksiyon göstermez bir Ubiquitin antikor kullanın.
    4. Bağlantı spesifik polyubiquitination için, lizin-27, lizin-48, lizin-63 ve doğrusal (M1) polyubiquitination algılayabilir antikorlar kullanın.
  2. Gelişmeler arasında çapraz kontaminasyon önlemek için, hangi bir yanlış pozitif neden olabilir veya farklı bir Ubiquitin modifikasyon görüntülemede müdahale, 10 dakika 0,1 M NaOH kullanarak gelişmeler arasında şeritler membranlar.
    1. TBS 'de membranları% 0,1 ile iki kez 10 dakika boyunca yıkayın ve yeniden engelleyin (kullanılan Batı leke protokolünde her türlü engelleme ajanı tercih edilir).
    2. Membranın primer ve ikincil antikorların düzgün bir şekilde çıkartıldığından emin olmak için, zarı ikincil antikor ile yeniden geliştir.
    3. Tavsiye edilen: Kirlenme olmaksızın farklı Ubiquitin antikorlarının başarılı bir şekilde geliştirilmesi için floresan veya yakın kızılötesi görüntüleme sistemlerini kullanın. Bu sıklıkla antikorlar arasında daha fazla engel olabilir.
  3. Bazı Ubiquitin Batı leke görüntüleri farklı bantları (M1 gibi) sütunlar sağlayacak diğerleri birkaç veya net çizgiler (K48 ile ortak) ile smear benzeri bir desen üretmek. Görüntülenmiş Ubiquitin Batı blots ölçümü için, tüm moleküler standartları merdiven genişletir sütunun etrafında bir kutu çizin.
    1. Ubiquitin boyama tüm merdiven boyunca uzatırsanız kutuyu yukarı (veya aşağı) ayarlayın; Bu Lysine-48 modifikasyonları için yaygındır ve hücre içi bölmeler arasında yaygın olarak değişir.
    2. Arka planda, her tarafta sütunu hemen çevreleyen arka plan ortalama optik yoğunluğu olarak hesaplanır dışarı çıkarın.

Sonuçlar

Burada açıklanan prosedürü kullanarak, sıçan beynin lateral amigdala nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonları toplandı (Şekil 1). Bireysel fraksiyonları saflık Batı blotting ile teyit edildi, zenginleştirilmiş veya lysate tükenmelidir proteinlere karşı antikorlar ile yoklama. Ham sinaptik fraksiyonu toplanan ilk yarımküte, postsinaptik yoğunluk protein 95 (PSD95) sinaptik vardı, ancak nükleer değil, kesir, sitoplazmada alt seviye...

Tartışmalar

Burada, aynı hayvanın farklı hücre içi bölmeleri boyunca Ubiquitin-proteasom aktivitesinde yapılan değişikliklerin ölçülmeleri için etkili bir yöntem gösteriyoruz. Şu anda, Ubiquitin-proteasome sisteminin aktivitesinde hücre altı değişiklikleri ölçme girişimleri çoğu örnek başına tek bir bölme ile sınırlıdır, denemeler tekrarlamak gerek sonuçlanan. Bu önemli maliyetlere ve hayvan yaşamının kaybına yol açar. Protokollerimiz, aynı hayvanın her yarımküünden toplanacak farklı hü...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, tarım ve Yaşam Bilimleri Koleji ve Virginia Tech Bilim Koleji başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir. tan, Virginia Tech 'de George Washington Carver programı tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTAFisher15575020Various other vendors
20S Proteasome Activity KitMillipore SigmaAPT280Other vendors carry different versions
ATPFisherFERR1441Various other vendors
Beta-actin antibodyCell signaling4967SVarious other vendors
Beta-tubulin antibodyCell signaling2128TVarious other vendors
BioTek Synergy H1 plate readerBioTekVATECHH1MT3Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanolFisherICN19024280Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactoneMillipore SigmaL7035Various other vendors
Cryogenic cupFisher033377BVarious other vendors
DMSODMSOD8418Varous other vendors
DTTMillipore SigmaD0632Various other vendors
GlycerolMillipore SigmaG5516Various other vendors
H3 antibodyAbcamab1791Various other vendors
HEPESMillipore SigmaH3375Various other vendors
Hydrochloric acidFisherSA48Various other vendors
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021Various other vendors
K48 Ubiquitin AntibodyAbcamab140601Various other vendors
K63 Ubiquitin AntibodyAbcamab179434Various other vendors
KClMillipore SigmaP9541Various other vendors
KONTES tissue grinderVWRKT885300-0002Various other vendors
Laemmli sample bufferBio-rad161-0737Various other vendors
Linear Ubiquitin AntibodyLife SensorsAB-0130-0100Only M1 antibody
MgClMillipore Sigma442611Various other vendors
MicrocentrifugeEppendorf2231000213Various other manufacturers/models
myr-AIPEnzo Life SciencesBML-P212-0500Carried by Millipore-Sigma
NaClMillipore SigmaS3014Various other vendors
Odyssey Fc Imaging SystemLiCor2800-02Other vendors carry different versions
Phosphatase InhibitorMillipore Sigma524625Various other vendors
Precision Plus Protein StandardBio-rad161-0373Various other vendors
Protease InhibitorMillipore SigmaP8340Various other vendors
PSD95 antibodyCell signaling3450TVarious other vendors
SDSMillipore SigmaL3771Various other vendors
Sodium hydroxideFisherSS255Various other vendors
SucroseMillipore SigmaS0389Various other vendors
TBSAlfa AesarJ62938Varous other vendors
TrisMillipore SigmaT1503Various other vendors
Tween-20FisherBP337-100Various other vendors
Ubiquitin AntibodyEnzo Life SciencesBML-PW8810Various other vendors

Referanslar

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimsay 147Ubiquitinproteasomeekirdeksinapssitoplazmahaf zahipokampusamigdala

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır