Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

Resumo

Este protocolo é projetado para quantificar eficientemente a atividade do sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) em diferentes compartimentos celulares do cérebro de roedores. Os usuários podem examinar o funcionamento da UPS em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas no mesmo animal, reduzindo a quantidade de tempo e o número de animais necessários para realizar essas análises complexas.

Resumo

O sistema do ubiquitin-proteasome é um regulador chave da degradação da proteína e de uma variedade de outros processos celulares nos eukaryotes. No cérebro, aumentos na atividade de ubiquitina-proteasome são críticos para a formação de plasticidade sináptica e memória e alterações aberrantes neste sistema estão associados a uma variedade de distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e psiquiátricos. Um dos problemas no estudo do funcionamento do ubiquitina-proteasome no cérebro é que ele está presente em todos os compartimentos celulares, nos quais as metas proteicas, o papel funcional e os mecanismos de regulação podem variar muito. Como resultado, a capacidade de comparar diretamente a segmentação de proteínas de ubiquitina cerebral e a atividade catalítica de Proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares dentro do mesmo animal é fundamental para compreender plenamente como a UPS contribui para a plasticidade sináptica, memória e doença. O método descrito aqui permite a coleta de frações sinápticas nucleares, citoplasmáticas e brutas do mesmo cérebro de roedores (Rat), seguidas pela quantificação simultânea da atividade catalítica do Proteassoma (indiretamente, proporcionando atividade do núcleo Proteassoma apenas) e marcação de proteínas de ubiquitina específica de ligação. Assim, o método pode ser usado para comparar diretamente as mudanças subcelulares na atividade do ubiquitin-proteasome em regiões diferentes do cérebro no mesmo animal durante a plasticidade sináptica, a formação da memória e Estados diferentes da doença. Este método também pode ser utilizado para avaliar a distribuição subcelular e a função de outras proteínas dentro do mesmo animal.

Introdução

O sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) é uma complexa rede de estruturas proteicas interconectadas e ligases que controla a degradação da maioria das proteínas de vida curta nas células¹. Neste sistema, as proteínas são marcadas para a degradação ou outros processos/destinos celulares pelo pequeno modificador ubiquitina. Uma proteína alvo pode adquirir 1-7 modificações de ubiquitina, que podem se unir em um dos sete sítios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) ou o N-terminal metionina (M1; conhecido como linear) na ubiquitina anterior². Algumas dessas tags de poliubiquitina são específicas da degradação (K48)³, enquanto outras são em grande parte independentes do processo de degradação da proteína (M1)^4,5,6. Assim, o processo de ubiquitinação de proteínas é incrivelmente complexo e a capacidade de quantificar as alterações em uma tag de poliubiquitina específica é fundamental para finalmente entender o papel dessa modificação dada no funcionamento celular. Complicando ainda mais o estudo deste sistema, o proteasome, que é a estrutura catalítica do UPS⁷, ambos degrada proteínas, mas também pode estar envolvido em outros processos não proteolíticos^8,9. Não surprisingly então, desde que sua descoberta inicial, atividade normal e aberrante do ubiquitin-proteasome foi implicada na formação a longo prazo da memória e em uma variedade de Estados da doença, incluindo muitos neurológicos, neurodegenerativas e psiquiátricas distúrbios^10,11. Como resultado, os métodos que podem efetivamente e eficientemente quantificar a atividade da UPS no cérebro são essenciais para finalmente compreender como este sistema é desregulado nos Estados de doença e o eventual desenvolvimento de opções de tratamento visando ubiquitina e/ou funcionamento do Proteassoma.

Há um número de edições em quantificar a atividade do ubiquitin-proteasome no tecido de cérebro dos ratos e dos ratos, que são os sistemas modelo os mais comuns usados para estudar a função do UPS, incluindo 1) a diversidade de modificações do ubiquitin, e 2) distribuição e regulação diferencial da UPS funcionando em compartimentos subcelulares^12,13,14. Por exemplo, muitas das primeiras manifestações da função de ubiquitina-Proteassoma no cérebro durante a formação da memória usaram lisados de células inteiras e indicaram aumentos dependentes do tempo em ambas as proteínas ubiquitinação e Proteassoma atividade^{15, 16 anos} de ^{, 17} anos de ^{, 18 anos} de ^{, 19} anos de ^{, 20}. no entanto, descobrimos recentemente que a atividade ubiquitina-proteasome variou amplamente entre os compartimentos subcelulares em resposta à aprendizagem, com aumentos simultâneos em algumas regiões e diminui em outros, um padrão que difere significativamente do que foi relatado previamente em lysates inteiros da pilha²¹. Isso é consistente com a limitação de uma abordagem de célula inteira, pois não pode dissociar a contribuição de mudanças na atividade da UPS em diferentes compartimentos subcelulares. Embora estudos mais recentes tenham empregado protocolos de fração sináptica para estudar a UPS especificamente em sinapses em resposta à aprendizagem^22,23,²⁴, os métodos utilizados oclusam a capacidade de medir alterações de ubiquitina-proteasome nucleares e citoplasmáticas no mesmo animal. Isso resulta em uma necessidade desnecessária de repetir experimentos várias vezes, coletando uma fração subcelular diferente em cada um. Não só isso resulta em uma maior perda de vida animal, mas elimina a capacidade de comparar diretamente a atividade da UPS em diferentes compartimentos subcelulares em resposta a um determinado evento ou durante um estado de doença específica. Considerando que os alvos proteicos da ubiquitina e do Proteassoma variam amplamente em toda a célula, compreender como a sinalização de ubiquitina-Proteassoma difere em compartimentos subcelulares distintos é fundamental para identificar o papel funcional da UPS na cérebro durante a formação da memória e desordens neurológicas, neurodegenerativas e psiquiátricas.

Para abordar esta necessidade, nós desenvolvemos recentemente um procedimento em que as frações nucleares, cytoplasmic e sináptica poderiam ser coletadas para uma determinada região do cérebro do mesmo animal²¹. Adicionalmente, para dar conta da quantidade limitada de proteínas que podem ser obtidas a partir da coleta de múltiplas frações subcelulares da mesma amostra, otimizamos protocolos previamente estabelecidos para o ensaio de atividade Proteassoma in vitro e ligação específica ubiquitinação da proteína em pilhas lysed coletadas do tecido de cérebro do roedor. Utilizando este protocolo, pudemos coletar e comparar diretamente as mudanças dependentes da aprendizagem na atividade Proteassoma, K48, K63, M1 e níveis globais de poliubiquitinação protéica no núcleo e citoplasma e nas sinapses na amígdala lateral de ratos. Aqui, descrevemos detalhadamente nosso procedimento (Figura 1), o que pode melhorar significativamente nossa compreensão de como a UPS está envolvida na formação de memória de longo prazo e em vários Estados de doenças. Entretanto, deve-se notar que a atividade de Proteassoma in vitro discutida em nosso protocolo, embora amplamente utilizada, não mede diretamente a atividade de complexos completos de Proteassoma 26S. Em vez disso, este ensaio mede a atividade do núcleo 20s, o que significa que só pode servir como um proxy para entender a atividade do núcleo em si, em oposição ao complexo de todo o Proteassoma 26S.

Protocolo

Todos os procedimentos, incluindo os sujeitos animais, foram aprovados pelo Instituto Politécnico da Virgínia e pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual (IACUC).

1. coleta e dissecção do tecido cerebral de roedores

Nota: Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de regiões do cérebro e usado com vários procedimentos da coleção do tecido. Abaixo está o procedimento utilizado em nosso laboratório para subcelular de tecido cerebral de rato, usando 8-9 semana de idade machos Sprague Dawley ratos. A fim de processar todos os compartimentos celulares no mesmo animal, seção 1,3. deve ser seguido independentemente do procedimento de coleta de tecido utilizado.

1. Extraia o cérebro de rato e coloque em um copo criogênico pré-refrigerado em gelo seco. Flash-congelar o cérebro em gelo seco, ou usar nitrogênio líquido, se disponível, e transferir para um-80 ° c freezer. Cérebros podem ser dissecados no mesmo dia ou em um momento posterior.
2. Retire o cérebro congelado do copo criogênico e coloque em uma matriz de cérebro de rato refrigerada com gelo seco. Cada slot na matriz corresponde a 0,5 mm, que pode ser usado para determinar a localização aproximada da região de interesse (ROI).
   1. Usando um Atlas de cérebro de rato, insira uma lâmina de barbear na matriz imediatamente na frente (anterior) do início previsto do ROI. Em seguida, insira uma lâmina de barbear imediatamente na extremidade prevista (posterior) do ROI.
   2. Retire a fatia entre as lâminas de barbear usando um bisturi e coloque em uma lâmina de microscópio refrigerada em gelo seco. Normalmente, as seções são 2-3 mm de espessura, mas isso varia de acordo com o ROI.
3. Usando um bisturi, dissecar o ROI um hemisfério de cada vez. Coloque cada hemisfério em separado 1,5 mL microcentrífuga tubos pré-refrigerados em gelo seco. O tecido congelado pode imediatamente ser usado para o fraccionamento subcellular ou processado em uma estadia mais atrasada se armazenado em-80 ° c.

2. extração nuclear e citoplasmática

Nota: Este protocolo utiliza soluções de estoque pré-fabricados de produtos químicos de laboratório comuns, incluindo 0,1 M HEPES, 1 M MgCl₂, 1 m Dithiothreitol (DTT), 0,5 M de ácido ETILENODIAMINOTETRACÉTICO (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) e 50% glicerol. Se o valor-limite é usado em ensaios da atividade do Proteassoma, o glicerol e o ATP podem ser adicionados a todos os bufferes para ajudar a impedir a desmontagem de complexos do Proteassoma durante o lysis.

1. Prepare o tampão de Lise. Adicionar 8,63 mL de água ultrapura (desionizada e destilada) a um tubo cônico estéril de 15 mL.
   1. Para o tubo cônico, adicionar 1.000 μL de 0,1 M HEPES, 15 μL de 1 M MgCl, 100 μL de 1 M DTT e 50 μL de 10% NP-40.
   2. Adicionar 100 μL de cocktail inibidor da protease e 100 μL de cocktail inibidor da fosfatase. Momentaneamente Vortex a solução para misturar e coloc no gelo molhado para refrigerar. Note que a solução pode ter uma tonalidade amarela do inibidor da fosfatase.
      Nota: O uso de inibidores da protease é essencial para preservar a proteína e garantir a especificidade do ensaio de atividade de Proteassoma in vitro. No entanto, esses inibidores também podem resultar em uma ligeira redução na atividade Proteassoma, o que significa que a atividade medida no ensaio in vitro pode ser uma subestimar os níveis de atividade real.
2. Prepare o buffer de extração. Adicionar 5,925 mL de água ultrapura (desionizada e destilada) a um tubo cônico estéril de 15 mL.
   1. Para o tubo cônico, adicionar 2.000 μL de 0,1 M HEPES, 1250 μL de glicerol de 50%, 15 μL de 1 M MgCl_2,5μL de 1 m DTT, 5 μl de 0,5 m de EDTA e 600 μl de NaCl de 5 m.
   2. Adicionar 100 μL de cocktail inibidor da protease e 100 μL de cocktail inibidor da fosfatase. Momentaneamente Vortex a solução para misturar e coloc no gelo molhado para refrigerar. Note que a solução pode ter uma tonalidade amarela do inibidor da fosfatase.
3. Retire o microtubo de centrifugação de 1,5 mL contendo um hemisfério do ROI do congelador-80 ° c. Assegure-se de que o hemisfério usado seja contrabalançado entre as condições de extração para cada grupo experimental. Por exemplo, em um experimento de dois grupos, use o hemisfério esquerdo para os dois primeiros animais em cada grupo e o hemisfério direito para as próximas duas amostras, etc.
4. Usando um bisturi, transfira o tecido cerebral congelado para um homogeneizador de Teflon de vidro de 2 mL. Adicionar 500 μL de tampão de Lise ao tubo de Teflon.
   1. Usando o pilão B, Homogeneize o mesmo tecido usando 15 cursos até que nenhuma quantidade visível de material contínuo esteja atual. Use um movimento de giro (no sentido horário ou anti-horário) durante cada curso.
5. Utilizando uma pipeta de 1.000 μL, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo molhado e incubar por 30 min.
6. Coloque o tubo em microcentrífuga e gire por 10 min a 845 x g e 4 ° c. Após a conclusão, Retire cuidadosamente o sobrenadante introduzindo pipetagem e coloque-o num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; Esta é a fração citoplasmática, que pode ser armazenada no gelo ou a 4 ° c até a seção 2,9.
7. Adicionar 50 μL de tampão de extração ao pellet resultante e ressuscitar por pipetagem. Não vórtice o pellet. Coloque o tubo que contém o pellet resinado no gelo e incubar durante 30 min.
8. Coloque o tubo em microcentrífuga e gire por 20 min a 21.456 x g, 4 ° c. Após a conclusão, Retire cuidadosamente o sobrenadante introduzindo pipetagem e coloque-o num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; Esta é a fração nuclear. O pellet agora pode ser Descartado.
9. Medir a concentração proteica das extrações citoplasmáticas e nucleares usando o ensaio de proteína DC (de acordo com as instruções do fabricante), ou qualquer ensaio equivalente para amostras coletadas usando detergentes não-iônicos. Proceder imediatamente ao ensaio de atividade de Proteassoma (secção 4) ou western blotting (secção 5). Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas em-80 ° c até que necessário.

3. coleção de fração sináptica

Nota: Este protocolo utiliza soluções de estoque pré-fabricados de produtos químicos de laboratório comuns, incluindo 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl e 10% SDS. Se o valor-limite é usado em ensaios da atividade do Proteassoma, o glicerol e o ATP podem ser adicionados a todos os bufferes para ajudar a impedir a desmontagem de complexos do Proteassoma durante o lysis

1. Prepare o tampão TEVP com 320 mM de sacarose. Adicionar 60 mL de água ultrapura (desionizada e destilada) a um copo limpo de 100 mL.
   1. Para a taça, adicione 1.300 μL de Tris de 1 M (pH 7,5), 260 μL de EDTA de 0,5 M, 100 μL de cocktail de inibidor de protease, 100 μL de cocktail inibidor da fosfatase e 10,944 g de sacarose. Misture com uma barra de agitação até que a sacarose esteja completamente dissolvida.
   2. Traga o pH a ~ 7,4 adicionando o ácido clorídrico (HCL) gota gota à solução usando uma pipeta.
   3. Transfira a solução para um balão volumétrico de 100 mL. Traga o volume a 100 ml adicionando a água ultrapura. Chill a solução final no gelo até que necessário.
2. Prepare o buffer de homogeneização. Adicionar 60 mL de água ultrapura (desionizada e destilada) a um copo limpo de 100 mL.
   1. Para a taça, adicione 5.000 μL de Tris de 1 M (pH 7,5), 3.000 μL de NaCl de 5 M, 100 μL de cocktail de inibidor de protease, 100 μL de cocktail inibidor da fosfatase e 2.000 μL de SDS de 10%. Misture com uma barra de agitação.
      Nota: Os detergentes iónicos podem interferir com os ensaios da atividade do Proteassoma resultando na desnaturação do complexo do Proteassoma. O volume de SDS poderia ser abaixado para ajudar a preservar a função do Proteassoma se desejado.
   2. Traga o pH a ~ 7,4 adicionando o HCl gota gota à solução usando uma pipeta.
   3. Transfira a solução para um balão volumétrico de 100 mL. Traga o volume para 100 mL adicionando água ultrapura. Armazene a solução final à temperatura ambiente; Não Chill como SDS vai precipar fora da solução.
3. Retire a centrífuga de 1,5 mL contendo um hemisfério do ROI do congelador-80 ° c. Assegure-se de que o hemisfério usado seja contrabalançado entre as condições de extração para cada grupo experimental. Por exemplo, em um experimento de dois grupos, use o hemisfério esquerdo para os dois primeiros animais em cada grupo e o hemisfério direito para as próximas duas amostras, etc.
4. Usando um bisturi, transfira o tecido cerebral congelado para um homogeneizador de Teflon de vidro de 2 mL. Adicionar 500 μL de tampão TEVP ao tubo de Teflon.
   1. Usando o pilão B, Homogeneize o mesmo tecido usando 15 cursos até que nenhuma transferência visível do material contínuo esteja atual. Use um movimento de giro (no sentido horário ou anti-horário) durante cada curso.
5. Utilizando uma pipeta de 1.000 μL, transfira a amostra homogeneizada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a amostra em 1.000 x g por 10 min, 4 ° c.
6. Colete o sobrenadante e transfira para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta de 1.000 μL. Centrifugue a amostra em 10.000 x g por 10 min, 4 ° c. O pellet original (P1) contém núcleos e os grandes detritos e pode ser Descartado.
7. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Esta é uma fração citosólica. Adicionar 50 μL de tampão de homogeneização ao pellet (P2) e ressuscitar introduzindo pipetagem até que não seja visível nenhum material sólido.
8. Centrifugue a amostra em 20.000 x g por 10 min, 4 ° c. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; Esta é a membrana Synaptosomal bruta (Synaptic) fração. A pelota pode ser descartada.
9. Meça a concentração proteica da fração sináptica usando o ensaio de proteína DC (de acordo com as instruções do fabricante), ou qualquer ensaio equivalente para amostras coletadas usando detergentes iônicos. Proceder imediatamente ao ensaio de atividade de Proteassoma (secção 4) ou western blotting (secção 5). Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas em-80 ° c até que necessário.

4. ensaio de atividade de proteasome

Nota: A atividade do proteasome pode ser medida no tecido de cérebro homogeneizado usando uma versão ligeiramente modificada do kit de atividade de Proteasome 20S. Este ensaio não mede diretamente a atividade de complexos completos do Proteassoma 26S. Em vez disso, ele mede a atividade do núcleo 20s, o que significa que só pode servir como um proxy para entender a atividade do núcleo em si, em oposição a todo o complexo de Proteassoma 26S. O sucesso deste ensaio diminui com ciclos repetidos do Freeze-Thaw e/ou níveis crescentes de detergentes, particularmente iônicos, e exige o uso de um leitor da placa com um conjunto de filtro 360/460 (excitação/emissão) e capacidades de aquecimento até 37 ° c.

1. Configurações do leitor de placas: pré-aqueça a 37 ° c e segure a corrida.
   1. Ajuste a excitação a 360 e a emissão a 460. Se a placa 96 bem utilizada for clara, defina a posição óptica para baixo. Se uma placa de poço escuro/preto 96 for usada, ajuste a posição óptica para cima.
   2. Ajuste modelos mais velhos do leitor da placa ao auto-ganho as opções lidas fluorescentes; modelos mais recentes são predefinidos para isso. Programe uma corrida cinética com um tempo de 2 h, digitalização (leitura) a cada 30 min.
2. Reconstituir o tampão de ensaio 10x fornecido no kit com 13,5 mL de água ultrapura. Adicionar 14 μL de 100 mM ATP para o buffer agora 1x; Isso aumenta significativamente a atividade de Proteassoma nas amostras e melhora a confiabilidade do ensaio. O tampão final do ensaio 20S pode ser armazenado no gelo ou em 4 ° c até necessário e é estável por diversos meses.
3. Reconstituir o padrão AMC fornecido em kit com 100 μL de DMSO. Realize esta etapa no escuro ou condições de pouca luz, como o padrão é sensível à luz.
4. Crie uma curva de suporte da AMC usando o padrão reconstituído, no escuro ou condições de pouca luz.
   1. Em tubos de microcentrífuga separados de 0,5 mL, adicione 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 μL do padrão AMC, que corresponde a 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0 μM de concentração de AMC.
   2. Para estes tubos, na mesma ordem, adicione 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 e 100 μL de tampão de ensaio 20S. Isto cria uma série de concentrações elevadas a baixas de AMC, que serão usadas para a calibração do leitor da placa e a análise da atividade do Proteassoma nas amostras homogeneizadas.
   3. Armazene todos os padrões diluídos no gelo no escuro até que seja necessário.
5. Reconstituir o substrato Proteassoma (suc-llvy-AMC) fornecido em kit com 65 μL de DMSO. Realize esta etapa no escuro ou condições de pouca luz, pois o substrato é sensível à luz. Crie uma diluição 1:20 da carcaça do Proteassoma em um tubo novo do microcentrifugador de 1,5 ml usando o amortecedor do ensaio 20s. Guarde o substrato diluído no gelo no escuro até que seja necessário.
   Nota: Por exemplo, se a placa terá 10 amostras e 1 em branco, você vai precisar de substrato diluído suficiente para 22 poços (com duplicatas) a 10 μL por poço. Isso equivale a 220 μL de necessidade + 30 μL para erros de pipetagem, exigindo 12,5 μL de substrato e 237,5 μL de tampão de ensaio 20S.
6. Descongelar amostras desejadas (se congeladas) e adicionar uma quantidade normalizada a uma placa de poço 96. Execute cada amostra em duplicatas. A quantidade de amostra necessária varia com base na preparação do tecido. Geralmente, 10-20 μg é suficiente para qualquer fração subcelular.
7. Traga o volume da amostra para 80 μL com água ultrapura. O valor adicionado depende do volume de amostra adicionado. Por exemplo, se a amostra 1 foi de 4,5 μL de proteína e a amostra 2 foi de 8,7 μL, a quantidade de água necessária será de 75,5 μL e 71,3 μL, respectivamente. Em dois poços separados, adicione 80 μL de água isoladamente; Estes serão os espaços em branco do ensaio.
   Nota: A fim limitar mudanças no volume da proteína devido aos erros de pipetagem, as concentrações da proteína podem ser normalizadas à amostra menos concentrada. Isso permitirá o uso do mesmo volume de amostra em todas as condições.
8. Adicione 10 μL de tampão de ensaio 20S a cada poço, incluindo o ensaio em branco. Um repetidor/pipeta automatizada é recomendado aqui para assegurar o volume consistente do ensaio através dos poços.
9. Opcional: Nesta fase, introduzir manipulações in vitro, se desejado; Isto exigirá que cada amostra tenha 2 poços adicionais por tratamento, incluindo o veículo. Em caso afirmativo, adicionar 5-10 μL de fármaco/composto de interesse para 2 dos poços da amostra e um volume equivalente de controle/veículo para outros 2 poços. Coloc a placa no leitor pre-aquecido da placa ou em uma incubadora de 37 ° c por 30 minutos.
10. Desligue as luzes ou entrar em um quarto escuro. Adicione todos os 100 μL de padrões de AMC diluídos a um poço novo; cada padrão terá um único poço.
11. No escuro, adicione 10 μL de substrato de Proteassoma diluído a poços contendo amostra e ensaios em branco, mas não ao padrão AMC. Um repetidor/pipeta automatizada é recomendado aqui para assegurar o volume consistente do ensaio através dos poços.
12. Coloc a placa no leitor da placa e comece a corrida cinética.
    Nota: A placa não precisa estar agitação constante durante a corrida cinética, no entanto, o usuário pode escolher se desejar
13. No final da execução cinética, exporte valores brutos 360/460 fluorescentes para o Microsoft Excel.
    1. Médias juntas duplicam poços para cada padrão, cada amostra e o ensaio em branco para todas as 5 varreduras. Os valores fluorescentes brutos devem aumentar através de varreduras para as amostras, mas permanecem estáveis (ou diminuem ligeiramente) para padrões e ensaios em branco.
    2. Tome o mais alto padrão AMC bem médio e divida pela concentração conhecida (20 μM). Divida esse valor pela concentração de amostra usada no ensaio para obter o valor padronizado da AMC. Para cada amostra e média de ensaio em branco, divida pelo valor padronizado da AMC.
    3. Tome este valor final e divida pela concentração da amostra usada no ensaio para obter o valor normalizado para cada amostra e o ensaio em branco. Faça isso para todas as 5 varreduras.
    4. Subtrair o valor normalizado de ensaio em branco de cada valor de amostra normalizado para todas as 5 verificações.

5. quantificação da Ubiquitinação de proteínas específicas de ligação

1. A quantificação de etiquetas diversas do poliubiquitina em frações subcellular diferentes coletadas do tecido do cérebro do roedor deve ser feita usando uma variedade de protocolos de mancha ocidentais padrão em combinação com os anticorpos originais, enlace-específicos do poliubiquitina.
   1. Para desnaturar, misture as amostras normalizadas com um volume igual de tampão de amostra de Laemmli suplementado com β-Mercaptoetanol a uma percentagem de 5% em volume, por instrução do fabricante.
   2. Para a quantificação de todas as modificações da monoubiquitinação e do oxigênio não obstante o enlace, use um anticorpo da bandeja-ubiquitina.
   3. Para reconhecer todas as proteínas polyubiquitinated, use um anticorpo do ubiquitin que não cruze-reage com o monoubiquitination.
   4. Para o polyubiquitination ligação-específico, use os anticorpos que podem detectar o lysine-27, o lysine-48, o lysine-63 e o polyubiquitination linear (M1).
2. Para evitar a contaminação cruzada entre os desenvolvimentos, o que poderia resultar em um falso positivo ou interferir com a imagem de uma modificação ubiquitina diferente, as membranas de tira entre os desenvolvimentos usando 0,1 M NaOH por 10 min.
   1. Lave as membranas em TBS com 0,1% de interpolação duas vezes por 10 min e Rebloqueie (usando qualquer agente de bloqueio é preferível no protocolo Western blot usado).
   2. Incubar a membrana com o anticorpo secundário e redesenvolva a fim confirmar que a membrana estêve descascada de anticorpos preliminares e secundários corretamente.
   3. Recomendado: Para o desenvolvimento bem sucedido de anticorpos diferentes do ubiquitin sem contaminação, use sistemas fluorescentes ou do próximo-infravermelho da imagem latente. Isso muitas vezes pode impedir a transição entre os anticorpos.
3. Algumas imagens ocidentais do borrão do ubiquitin fornecerão colunas de faixas distintas (tais como M1) quando outro produzem um mancha-como o teste padrão com poucas ou nenhumas linhas desobstruídas (comuns com K48). Para a quantificação de blots ocidentais imaged do ubiquitin, desenhe uma caixa em torno da coluna que estende a escada inteira dos padrões moleculars.
   1. Ajuste a caixa acima (ou para baixo) se a mancha do ubiquitin se estende através da escada inteira; Isto é comum para as modificações de lysine-48 e varia extensamente através dos compartimentos subcellular.
   2. Subtraia o plano de fundo, que é calculado como a densidade óptica média do plano de fundo imediatamente ao redor da coluna em todos os lados.

Resultados

Usando o procedimento descrito aqui, frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas foram coletadas da amígdala lateral do cérebro de rato (Figura 1). A pureza das frações individuais foi confirmada via Western blotting, sondagem com anticorpos contra proteínas que devem ser enriquecidas ou esgotadas no lisado. No primeiro hemisfério onde foi coletada uma fração sináptica bruta, a proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD95) estava presente...

Discussão

Aqui, Nós demonstramos um método eficiente para quantificar mudanças na atividade do ubiquitin-proteasome através dos compartimentos subcellular diferentes no mesmo animal. Atualmente, a maioria das tentativas de medir as alterações subcelulares na atividade do sistema ubiquitina-proteasome tem se limitado a um único compartimento por amostra, resultando na necessidade de repetição de experimentos. Isso leva a custos significativos e perda de vida animal. Nosso protocolo alivia esse problema dividindo os hemisf?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Fisher	15575020	Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit	Millipore Sigma	APT280	Other vendors carry different versions
ATP	Fisher	FERR1441	Various other vendors
Beta-actin antibody	Cell signaling	4967S	Various other vendors
Beta-tubulin antibody	Cell signaling	2128T	Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	VATECHH1MT3	Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol	Fisher	ICN19024280	Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone	Millipore Sigma	L7035	Various other vendors
Cryogenic cup	Fisher	033377B	Various other vendors
DMSO	DMSO	D8418	Varous other vendors
DTT	Millipore Sigma	D0632	Various other vendors
Glycerol	Millipore Sigma	G5516	Various other vendors
H3 antibody	Abcam	ab1791	Various other vendors
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Various other vendors
Hydrochloric acid	Fisher	SA48	Various other vendors
IGEPAL (NP-40)	Millipore Sigma	I3021	Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody	Abcam	ab140601	Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody	Abcam	ab179434	Various other vendors
KCl	Millipore Sigma	P9541	Various other vendors
KONTES tissue grinder	VWR	KT885300-0002	Various other vendors
Laemmli sample buffer	Bio-rad	161-0737	Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody	Life Sensors	AB-0130-0100	Only M1 antibody
MgCl	Millipore Sigma	442611	Various other vendors
Microcentrifuge	Eppendorf	2231000213	Various other manufacturers/models
myr-AIP	Enzo Life Sciences	BML-P212-0500	Carried by Millipore-Sigma
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System	LiCor	2800-02	Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor	Millipore Sigma	524625	Various other vendors
Precision Plus Protein Standard	Bio-rad	161-0373	Various other vendors
Protease Inhibitor	Millipore Sigma	P8340	Various other vendors
PSD95 antibody	Cell signaling	3450T	Various other vendors
SDS	Millipore Sigma	L3771	Various other vendors
Sodium hydroxide	Fisher	SS255	Various other vendors
Sucrose	Millipore Sigma	S0389	Various other vendors
TBS	Alfa Aesar	J62938	Varous other vendors
Tris	Millipore Sigma	T1503	Various other vendors
Tween-20	Fisher	BP337-100	Various other vendors
Ubiquitin Antibody	Enzo Life Sciences	BML-PW8810	Various other vendors