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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Zusammenfassung

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist ein wichtiger Regulator des Proteinabbaus und einer Vielzahl anderer zellulärer Prozesse in Eukaryoten. Im Gehirn, Erhöhung enrubisiert-proteasom Aktivität sind entscheidend für synaptische Plastizität und Gedächtnisbildung und aberrante Veränderungen in diesem System sind mit einer Vielzahl von neurologischen, neurodegenerativen und psychiatrischen Störungen verbunden. Eines der Probleme bei der Untersuchung der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn ist, dass es in allen zellulären Kompartimenten vorhanden ist, in denen die Proteinziele, die funktionelle Rolle und die Regulationsmechanismen sehr unterschiedlich sein können. Infolgedessen ist die Fähigkeit, das Gehirn-Ubiquitin-Protein-Targeting und die katalytische Aktivität des Proteasomen in verschiedenen subzellulären Kompartimenten innerhalb desselben Tieres direkt zu vergleichen, entscheidend für das vollständige Verständnis, wie die USV zur synaptischen Plastizität beiträgt. Gedächtnis und Krankheit. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Entnahme von kerntechnischen, zytoplasmatischen und rohen synaptischen Fraktionen aus demselben Nagetier (Ratten)-Gehirn, gefolgt von einer gleichzeitigen Quantifizierung der proteasomkatalytischen Aktivität (indirekt, die Aktivität des Proteasomkerns bereitstellt). ) und linkage-spezifische Ubiquitin-Protein-Tagging. So kann die Methode verwendet werden, um subzelluläre Veränderungen in der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in verschiedenen Hirnregionen im selben Tier während der synaptischen Plastizität, Gedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen direkt zu vergleichen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die subzelluläre Verteilung und Funktion anderer Proteine innerhalb desselben Tieres zu bewerten.

Einleitung

Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Proteinstrukturen und Ligasen, das den Abbau der meisten kurzlebigen Proteine in Zellen1steuert. In diesem System werden Proteine durch den kleinen Modifikator Ubiquitin für Abbau oder andere zelluläre Prozesse/Fates markiert. Ein Zielprotein kann 1-7 Ubiquitin-Modifikationen erwerben, die an einem von sieben Lysin(K)-Standorten (K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63) oder dem N-Terminal Methionin (M1; bekannt als linear) im vorherigen Ubiquitin2miteinander verknüpft werden können. Einige dieser Polyubiquitin-Tags sind abbauspezifisch (K48)3, während andere weitgehend unabhängig vom Proteinabbauprozess (M1)4,5,6sind. Daher ist der Protein-Ubiquitinationsprozess unglaublich komplex und die Fähigkeit, Veränderungen in einem bestimmten Polyubiquitin-Tag zu quantifizieren, ist entscheidend für das letztendliche Verständnis der Rolle dieser gegebenen Veränderung in der zellulären Funktion. Erschwerend kommt hinzu, dass die Untersuchung dieses Systems, das Proteasom,die katalytische Struktur der USV 7, sowohl Proteine abbaut, als auch aber auch an anderen nicht-proteolytischen Prozessen beteiligt sein kann8,9. Es überrascht nicht, dass seit seiner ersten Entdeckung eine normale und abnorme ubiquitin-proteasomische Aktivität in die Langzeitgedächtnisbildung und eine Vielzahl von Krankheitszuständen verwickelt ist, darunter viele neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen10,11. Infolgedessen sind Methoden, die die USS-Aktivität im Gehirn effektiv und effizient quantifizieren können, entscheidend für das letztendliche Verständnis, wie dieses System in Krankheitszuständen dysreguliert ist, und die letztendliche Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten, die auf Ubiquitin und/oder proteasom funktionadieren.

Es gibt eine Reihe von Problemen bei der Quantifizierung der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Hirngewebe von Ratten und Mäusen, die die häufigsten Modellsysteme sind, die verwendet werden, um die UPS-Funktion zu untersuchen, einschließlich 1) die Vielfalt der Ubiquitin-Modifikationen und 2) Die Verteilung und Differenzregelung der USUs-Funktion über subzelluläre Kompartimente12,13,14. Zum Beispiel verwendeten viele der frühen Demonstrationen der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn während der Gedächtnisbildung ganze Zelllysate und deuteten auf eine zeitabhängige Zunahme sowohl der Protein-Ubiquitination als auch der Proteasomenaktivität15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Vor kurzem stellten wir jedoch fest, dass die Ubiquitin-Proteasomen-Aktivität in den subzellulären Fächern als Reaktion auf das Lernen sehr unterschiedlich war, wobei in einigen Regionen gleichzeitig zunimmt und in anderen ein Muster abnimmt, das sich erheblich unterscheidet. von dem, was zuvor in ganzen Zelllysaten berichtet wurde21. Dies steht im Einklang mit der Einschränkung eines gesamten Zellansatzes, da er den Beitrag von Änderungen der USB-Aktivität über verschiedene subzelluläre Kompartimente hinweg nicht trennen kann. Obwohl neuere Studien synaptische Bruchprotokolle verwendet haben, um die USV speziell an Synapsen als Reaktion auf das Lernen22,23,24zu studieren, schließen die angewandten Methoden die Fähigkeit zur Messung kerntechnische und zytoplasmatische Ubiquitin-Proteasom-Veränderungen im selben Tier. Dies führt zu einer unnötigen Notwendigkeit, Experimente mehrmals zu wiederholen, wobei jeweils eine andere subzelluläre Fraktion gesammelt wird. Dies führt nicht nur zu einem größeren Verlust von Tierleben, sondern eliminiert auch die Möglichkeit, DIE USV-Aktivität in verschiedenen subzellulären Abteilungen als Reaktion auf ein bestimmtes Ereignis oder während eines bestimmten Krankheitszustands direkt zu vergleichen. Wenn man bedenkt, dass die Proteinziele von Ubiquitin und dem Proteasom in der Zelle sehr unterschiedlich sind, ist es entscheidend zu verstehen, wie sich die Ubiquitin-Proteasome-Signalisierung in verschiedenen subzellulären Kompartimenten unterscheidet, um die funktionelle Rolle der USB in der Gedächtnisbildung und neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen.

Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir vor kurzem ein Verfahren entwickelt, bei dem kerntechnische, zytoplasmatische und synaptische Fraktionen für eine bestimmte Hirnregion desselben Tieres gesammelt werden könnten21. Um die begrenzte Menge an Protein zu berücksichtigen, die aus der Entnahme mehrerer subzellulärer Fraktionen aus derselben Probe gewonnen werden kann, haben wir zuvor etablierte Protokolle optimiert, um die In-vitro-Proteasomaktivität und die linkage-spezifische Protein-Ubiquitination in lysierten Zellen aus Nagetier-Gehirngewebe gesammelt. Mit diesem Protokoll konnten wir lernabhängige Veränderungen der Proteasomaktivität K48, K63, M1 und der gesamten Proteinpolyubiquitination im Kern und Zytoplasma sowie an Synapsen in der lateralen Amygdala von Ratten sammeln und direkt vergleichen. Hier beschreiben wir detailliert unser Verfahren (Abbildung 1), das unser Verständnis davon, wie die USV an der Langzeitgedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt ist, erheblich verbessern könnte. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass die in unserem Protokoll diskutierte In-vitro-Proteasomaktivität zwar weit verbreitet ist, aber die Aktivität vollständiger 26S-Proteasomkomplexe nicht direkt misst. Vielmehr misst dieser Assay die Aktivität des 20S-Kerns, d. h. er kann nur als Proxy dienen, um die Aktivität des Kerns selbst im Gegensatz zum gesamten 26S-Proteasom-Komplex zu verstehen.

Protokoll

Alle Verfahren einschließlich tierischer Fächer wurden vom Virginia Polytechnic Institute und dem State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Sammlung und Zerlegung von Nagetier-Gehirngewebe

HINWEIS: Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Gehirnregionen angewendet und mit verschiedenen Gewebeentnahmeverfahren verwendet werden. Unten ist das Verfahren in unserem Labor für subzelluläre von Ratte Hirngewebe verwendet, mit 8-9 Wochen alten männlichen Sprague Dawley Ratten. Um alle Zellfächer im selben Tier zu verarbeiten, Abschnitt 1.3. unabhängig vom verwendeten Gewebeentnahmeverfahren befolgt werden.

  1. Extrahieren Sie das Rattenhirn und legen Sie es in eine kryogene Tasse, die auf Trockeneis vorgekühlt ist. Das Gehirn auf Trockeneis einfrieren oder flüssigen Stickstoff verwenden, falls verfügbar, und in einen -80 °C-Gefrierschrank übertragen. Gehirne können am selben Tag oder zu einem späteren Zeitpunkt seziert werden.
  2. Entfernen Sie das gefrorene Gehirn aus der kryogenen Tasse und legen Sie es in eine Rattenhirnmatrix, die mit Trockeneis gekühlt ist. Jeder Steckplatz auf der Matrix entspricht 0,5 mm, die verwendet werden können, um die ungefähre Position der Interessenregion (ROI) zu bestimmen.
    1. Mit einem Rat Brain Atlas legen Sie eine Rasierklinge unmittelbar vor dem vorhergesagten ROI-Start in die Matrix ein. Als nächstes legen Sie sofort eine Rasierklinge am vorhergesagten Ende (posterior) des ROI ein.
    2. Entfernen Sie die Scheibe zwischen den Rasierklingen mit einem Skalpell und legen Sie auf einem Mikroskop-Dia gekühlt auf Trockeneis. In der Regel sind die Abschnitte 2-3 mm dick, aber dies variiert je nach ROI.
  3. Skalpell mit hilfe eines Skalpells sezieren Sie den ROI jeweils eine Hemisphäre. Legen Sie jede Hemisphäre in separate 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre vorgekühlt auf Trockeneis. Gefrorenes Gewebe kann sofort zur subzellulären Fraktionierung verwendet oder zu einem späteren Zeitpunkt verarbeitet werden, wenn es bei -80 °C gelagert wird.

2. Nukleare und zytoplasmatische Extraktion

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet vorgefertigte Lagerlösungen von gängigen Laborchemikalien, einschließlich 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) und 50% Glycerin. Wenn Endpunkt in Proteasomen-Aktivitätstests verwendet wird, können Glycerin und ATP zu allen Puffern hinzugefügt werden, um die Demontage von Proteasom-Komplexen während der Lyse zu verhindern.

  1. Bereiten Sie den Lysis-Puffer vor. 8,63 ml ultrareines (deionisiertes und destilliertes) Wasser zu einem sterilen 15 ml konischen Rohr geben.
    1. Zum konischen Rohr 1.000 l 0,1 m HEPES, 15 l mit 1 M MgCl, 100 l 1 M DTT und 50 l mit 10% NP-40 hinzufügen.
    2. Fügen Sie 100 l Protease-Hemmer-Cocktail und 100 l Phosphatase-Inhibitor-Cocktail hinzu. Kurz wirbeln die Lösung zu mischen und auf nassem Eis zu kühlen. Beachten Sie, dass die Lösung eine gelbe Färbung aus dem Phosphatase-Inhibitor haben kann.
      HINWEIS: Die Verwendung von Proteasehemmern ist wichtig, um das Protein zu erhalten und die Spezifität des In-vitro-Proteasom-Aktivitäts-Assays zu gewährleisten. Diese Inhibitoren können jedoch auch zu einer leichten Verringerung der Proteasomenaktivität führen, was bedeutet, dass die am In-vitro-Test gemessene Aktivität eine Unterschätzung des tatsächlichen Aktivitätsniveaus sein kann.
  2. Bereiten Sie den Extraktionspuffer vor. 5,925 ml ultrareines (deionisiertes und destilliertes) Wasser zu einem sterilen 15 ml konischen Rohr geben.
    1. In das konische Rohr geben Sie 2.000 l 0,1 m HEPES, 1250 l 50 % Glycerin, 15 l von 1 M MgCl2, 5 l von 1 M DTT, 5 l mit 0,5 m EDTA und 600 l 5 M NaCl.
    2. Fügen Sie 100 l Protease-Hemmer-Cocktail und 100 l Phosphatase-Inhibitor-Cocktail hinzu. Kurz wirbeln die Lösung zu mischen und auf nassem Eis zu kühlen. Beachten Sie, dass die Lösung eine gelbe Färbung aus dem Phosphatase-Inhibitor haben kann.
  3. Entfernen Sie das 1,5 ml Zentrifugen-Mikrorohr, das eine Hemisphäre des ROI enthält, aus dem Gefrierschrank -80 °C. Stellen Sie sicher, dass die verwendete Hemisphäre für jede Versuchsgruppe über die Extraktionsbedingungen hinweg ausgeglichen wird. Verwenden Sie beispielsweise in einem Zwei-Gruppen-Experiment die linke Hemisphäre für die ersten beiden Tiere in jeder Gruppe und die rechte Hälfte für die nächsten beiden Proben usw.
  4. Übertragen Sie das gefrorene Hirngewebe mit einem Skalpell auf einen 2 ml Glas-Teflon-Homogenisator. Fügen Sie dem Teflonrohr 500 L Lysis-Puffer hinzu.
    1. Mit dem Stößel B homogenisieren Sie das gleiche Gewebe mit 15 Strichen, bis keine sichtbare Menge an festem Material vorhanden ist. Verwenden Sie bei jedem Hub eine Drehbewegung (im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn).
  5. Übertragen Sie die homogenisierte Probe mit einer 1.000-L-Pipette in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Legen Sie die Röhre auf nasses Eis und brüten Sie für 30 min.
  6. Rohr in Mikrozentrifuge geben und 10 min bei 845 x g und 4 °C drehen. Nach Abschluss des Überstandes vorsichtig durch Pipetten entfernen und in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben; Dies ist die Zytoplasma-Fraktion, die bis Abschnitt 2.9 auf Eis oder bei 4 °C gelagert werden kann.
  7. Fügen Sie dem resultierenden Pellet 50 L Extraktionspuffer hinzu und setzen Sie es durch Pipettieren wieder auf. Wirbeln Sie das Pellet nicht. Das Rohr mit dem resuspendierten Pellet auf Eis legen und 30 min inkubieren.
  8. Das Rohr in Mikrozentrifuge legen und 20 min bei 21.456 x g, 4 °C drehen. Nach Abschluss des Überstandes vorsichtig durch Pipetten entfernen und in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben; das ist die Kernfraktion. Das Pellet kann nun entsorgt werden.
  9. Messen Sie die Proteinkonzentration der zytoplasmatischen und nuklearen Extraktionen mit dem Dc-Protein-Assay (gemäß den Anweisungen des Herstellers) oder einem gleichwertigen Assay für Proben, die mit nichtionischen Reinigungsmitteln entnommen wurden. Fahren Sie sofort mit dem Proteasomen-Aktivitätstest (Abschnitt 4) oder dem Western Blotting (Abschnitt 5) fort. Alternativ können Proben bis zum Bedarf bei -80 °C gelagert werden.

3. Synaptic Fraction Collection

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet vorgefertigte Lagerlösungen von gängigen Laborchemikalien, einschließlich 1 M Tris (pH 7.5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl und 10% SDS. Wenn Endpunkt in Proteasom-Aktivitätstests verwendet wird, können Glycerin und ATP zu allen Puffern hinzugefügt werden, um die Demontage von Proteasom-Komplexen während der Lyse zu verhindern

  1. Bereiten Sie den TEVP-Puffer mit 320 mM Saccharose vor. 60 ml ultrareines (deionisiertes und destilliertes) Wasser in ein sauberes 100 ml Becherglas geben.
    1. Zum Becher geben Sie 1.300 l von 1 M Tris (pH 7,5), 260 l mit 0,5 m EDTA, 100 l Protease-Hemmer-Cocktail, 100 l Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und 10,944 g Saccharose. Mit einem Rührstab vermischen, bis Saccharose vollständig aufgelöst ist.
    2. Bringen Sie den pH-Wert auf 7,4 , indem Sie die Lösung tropfenweise mit einer Pipette in die Lösung einbringen.
    3. Übertragen Sie die Lösung in einen 100 ml Volumetkolben. Bringen Sie das Volumen auf 100 ml, indem Sie Reinstwasser hinzufügen. Kühlen Sie die endgültige Lösung auf Eis, bis sie benötigt wird.
  2. Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer vor. 60 ml ultrareines (deionisiertes und destilliertes) Wasser in ein sauberes 100 ml Becherglas geben.
    1. Zum Becher hinzufügen, fügen Sie 5.000 l von 1 M Tris (pH 7,5), 3.000 l von 5 M NaCl, 100 l Protease-Hemmer-Cocktail, 100 l Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und 2.000 l 10% SDS hinzu. Mit einer Rührstange mischen.
      HINWEIS: Ionische Detergenzien können die Proteasomenaktivitätstests stören, indem sie zur Denaturierung des Proteasom-Komplexes führen. Das Volumen von SDS könnte gesenkt werden, um die Proteasome-Funktion auf Wunsch zu erhalten.
    2. Bringen Sie den pH-Wert auf 7,4 , indem Sie hCl tropfenweise mit einer Pipette in die Lösung eintragen.
    3. Übertragen Sie die Lösung in einen 100 ml Volumetkolben. Bringen Sie das Volumen auf 100 ml, indem Sie Reinstwasser hinzufügen. Bewahren Sie die bei Raumtemperatur auf; nicht abkühlen, da SDS aus der Lösung herausfällt.
  3. Entfernen Sie die 1,5 ml Zentrifuge, die eine Hemisphäre des ROI enthält, aus dem Gefrierschrank -80 °C. Stellen Sie sicher, dass die verwendete Hemisphäre für jede Versuchsgruppe über die Extraktionsbedingungen hinweg ausgeglichen wird. Verwenden Sie beispielsweise in einem Zwei-Gruppen-Experiment die linke Hemisphäre für die ersten beiden Tiere in jeder Gruppe und die rechte Hälfte für die nächsten beiden Proben usw.
  4. Übertragen Sie das gefrorene Hirngewebe mit einem Skalpell auf einen 2 ml Glas-Teflon-Homogenisator. Fügen Sie dem Teflon-Rohr 500 L TEVP-Puffer hinzu.
    1. Mit dem Stößel B homogenisieren Sie das gleiche Gewebe mit 15 Strichen, bis keine sichtbaren Übertragungen von festem Material vorhanden sind. Verwenden Sie bei jedem Hub eine Drehbewegung (im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn).
  5. Übertragen Sie die homogenisierte Probe mit einer 1.000-L-Pipette in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.000 x g für 10 min, 4 °C.
  6. Sammeln Sie den Überstand und übertragen Sie mit einer 1.000-L-Pipette auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 x g für 10 min, 4 °C. Das Originalpellet (P1) enthält Kerne und die großen Trümmer und kann entsorgt werden.
  7. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Dies ist eine zytosolische Fraktion. Fügen Sie dem Pellet (P2) 50 L Homogenisierungspuffer hinzu und setzen Sie das Pellet (P2) wieder auf, bis kein festes Material sichtbar ist.
  8. Zentrifugieren Sie die Probe bei 20.000 x g für 10 min, 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr; Dies ist die Crude Synaptosomal Membrane (Synaptic) Fraktion. Das Pellet kann entsorgt werden.
  9. Messen Sie die Proteinkonzentration der Synaptischen Fraktion mit dem Dc-Protein-Assay (gemäß den Anweisungen des Herstellers) oder einem gleichwertigen Assay für Proben, die mit ionischen Reinigungsmitteln entnommen wurden. Fahren Sie sofort mit dem Proteasomen-Aktivitätstest (Abschnitt 4) oder dem Western Blotting (Abschnitt 5) fort. Alternativ können Proben bis zum Bedarf bei -80 °C gelagert werden.

4. Proteasom Aktivität Assay

HINWEIS: Die Proteasome-Aktivität kann in homogenisiertem Hirngewebe mit einer leicht modifizierten Version des 20S Proteasome Activity Kit gemessen werden. Dieser Test misst nicht direkt die Aktivität von kompletten 26S-Proteasom-Komplexen. Vielmehr misst sie die Aktivität des 20S-Kerns, d. h. sie kann nur als Stellvertreter dienen, um die Aktivität des Kerns selbst im Gegensatz zum gesamten 26S-Proteasom-Komplex zu verstehen. Der Erfolg dieses Testes nimmt mit wiederholten Frost-Tau-Zyklen und/oder steigenden Waschmitteln, insbesondere ionischen, ab und erfordert die Verwendung eines Plattenlesers mit einem Filtersatz 360/460 (Erregung/Emission) und Heizfähigkeiten bis 37 °C.

  1. Plattenlesereinstellungen: Vorwarm auf 37 °C und durch halten.
    1. Setzen Sie die Anregung auf 360 und die Emission auf 460. Wenn die verwendete 96-Wellplatte klar ist, stellen Sie die Optikposition auf Untenein. Wenn eine dunkel/schwarze 96-Wellplatte verwendet wird, stellen Sie die Optikposition auf Topein.
    2. Stellen Sie ältere Plattenlesermodelle unter den fluoreszierenden Leseoptionen auf Auto-Gain ein; neuere Modelle sind dafür voreingestellt. Programmieren Sie einen kinetischen Lauf mit einer Zeit von 2 h, Scannen (Lesen) alle 30 min.
  2. Rekonstituieren Sie den 10x Assay Puffer im Kit mit 13,5 ml Reinstwasser. Fügen Sie dem jetzt 1x-Puffer 14 l von 100 mM ATP hinzu; dies verbessert die Proteasomaktivität in den Proben erheblich und verbessert die Zuverlässigkeit des Assays. Der endgültige 20S Assay Puffer kann bis zum Bedarf auf Eis oder bei 4 °C gelagert werden und ist mehrere Monate stabil.
  3. Rekonstituieren Sie den im Kit enthaltenen AMC-Standard mit 100 L DMSO. Führen Sie diesen Schritt im Dunkeln oder bei schlechten Lichtverhältnissen aus, da der Standard lichtempfindlich ist.
  4. Erstellen Sie eine Standkurve von AMC mit dem rekonstituierten Standard, bei Dunkelheit oder bei schlechten Lichtverhältnissen.
    1. In separaten 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 und 0 l des AMC-Standards hinzufügen, was der AMC-Konzentration von 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0 M AMC entspricht.
    2. Zu diesen Röhren in der gleichen Reihenfolge, fügen Sie 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 und 100 l von 20S Assay Puffer. Dadurch entsteht eine Reihe von hohen bis niedrigen AMC-Konzentrationen, die für die Kalibrierung und Analyse der Proteasomaktivität in den homogenisierten Proben verwendet werden.
    3. Lagern Sie alle verdünnten Standards auf Eis im Dunkeln, bis sie benötigt werden.
  5. Rekonstituieren Sie das proteamische Substrat (Suc-LLVY-AMC) im Kit mit 65 l DMSO. Führen Sie diesen Schritt im Dunkeln oder bei schlechten Lichtverhältnissen durch, da das Substrat lichtempfindlich ist. Erstellen Sie eine 1:20 Verdünnung des Proteasomensubstrats in einem neuen 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 20S Assay Puffer. Das verdünnte Substrat bis zum Bedarf auf Eis im Dunkeln aufbewahren.
    HINWEIS: Wenn die Platte z. B. 10 Proben und 1 Rohling hat, benötigen Sie genügend verdünntes Substrat für 22 Brunnen (mit Duplikaten) bei 10 l pro Brunnen. Dies entspricht 220 l Bedarf + 30 l für Pipettierfehler, die 12,5 l Substrat und 237,5 l 20S Assay-Puffer erfordern.
  6. Gewünschte Proben auftauen (wenn sie gefroren sind) und eine normalisierte Menge zu einer 96-Well-Platte hinzufügen. Führen Sie jedes Beispiel in Duplikaten aus. Die benötigte Probenmenge variiert je nach Gewebevorbereitung. Im Allgemeinen reichen 10-20 g für jede subzelluläre Fraktion aus.
  7. Bringen Sie die Probe gut Volumen auf 80 l mit Reinstwasser. Der hinzugefügte Betrag hängt vom Volumen der hinzugefügten Probe ab. Wenn z. B. Probe 1 4,5 l Protein betrug und Probe 2 8,7 l betrug, beträgt die benötigte Wassermenge 75,5 l bzw. 71,3 l. In zwei separaten Brunnen, fügen Sie 80 L Wasser allein; dies werden die Assay Blanks sein.
    HINWEIS: Um Veränderungen des Proteinvolumens aufgrund von Pipettierfehlern zu begrenzen, können die Proteinkonzentrationen auf die am wenigsten konzentrierte Probe normalisiert werden. Dies ermöglicht die Verwendung des gleichen Probenvolumens unter allen Bedingungen.
  8. Fügen Sie jedem Brunnen 10 L 20S Assay-Puffer hinzu, einschließlich Assay Blanks. Eine Repeater/automatisierte Pipette wird hier empfohlen, um ein konsistentes Assay-Volumen über Brunnen hinweg zu gewährleisten.
  9. Optional: Führen Sie in diesem Stadium auf Wunsch In-vitro-Manipulationen ein; Dies erfordert, dass jede Probe zusätzliche 2 Brunnen pro Behandlung hat, einschließlich des Fahrzeugs. Wenn ja, fügen Sie 2 der Probenbrunnen und ein entsprechendes Kontroll-/Fahrzeugvolumen zu weiteren 2 Brunnen hinzu. Legen Sie die Platte 30 min auf den vorgewärmten Plattenleser oder in einen 37 °C-Inkubator.
  10. Schalten Sie die Lichter aus oder betreten Sie einen dunklen Raum. Fügen Sie alle 100 L verdünnten AMC-Standards zu einem neuen Brunnen hinzu; jeder Standard hat einen einzigen Brunnen.
  11. Fügen Sie im Dunkeln 10 l verdünntes Proteasomsubstrat in Brunnen mit Proben und Assay Blanks hinzu, jedoch nicht den AMC-Standard. Eine Repeater/automatisierte Pipette wird hier empfohlen, um ein konsistentes Assay-Volumen über Brunnen hinweg zu gewährleisten.
  12. Legen Sie die Platte in den Plattenleser und starten Sie den kinetischen Lauf.
    HINWEIS: Die Platte muss während des kinetischen Laufs nicht ständig gerührt sein, der Anwender kann jedoch auf Wunsch wählen,
  13. Exportieren Sie am Ende des kinetischen Durchlaufs rohe 360/460-Fluoreszenzwerte nach Microsoft Excel.
    1. Durchschnittlich zusammen doppelte Brunnen für jeden Standard, jede Probe und die Assay Blank für alle 5 Scans. Rohe Fluoreszenzwerte sollten bei Scans für die Proben ansteigen, aber für Standards und Assay Blanks stabil bleiben (oder leicht abnehmen).
    2. Nehmen Sie den höchsten AMC-Standard BrunnenDurchschnitt und dividieren Sie durch die bekannte Konzentration (20 m). Dividieren Sie diesen Wert durch die Im Test verwendete Probenkonzentration, um einen standardisierten AMC-Wert zu erhalten. Dividieren Sie für jede Probe und den Assay Blank-Durchschnitt durch den standardisierten AMC-Wert.
    3. Nehmen Sie diesen Endwert und dividieren Sie durch die im Test verwendete Probenkonzentration, um den normalisierten Wert für jede Probe und den Assay Blank zu erhalten. Führen Sie dies für alle 5 Scans durch.
    4. Subtrahieren Sie den normalisierten Assay Blank-Wert von jedem normalisierten Stichprobenwert für alle 5 Scans.

5. Quantifizierung der linkage-spezifischen Protein-Ubiquitination

  1. Die Quantifizierung verschiedener Polyubiquitin-Tags in verschiedenen subzellulären Fraktionen, die aus Nagetier-Hirngewebe gesammelt wurden, sollte mit einer Vielzahl von Standard-Western-Blotting-Protokollen in Kombination mit einzigartigen, linkage-spezifischen Polyubiquitin-Antikörpern erfolgen.
    1. Zur Denaturierung die normalisierten Proben mit einem gleichen Volumen von Laemmli-Probenpuffer mischen, ergänzt durch das Mitband-Mercaptoethanol auf einen Volumenprozentsatz von 5 Volumenprozent, wie der Hersteller vorgibt.
    2. Zur Quantifizierung aller Monoubiquitinations- und Polyubiquitinationsmodifikationen unabhängig von der Verbindung verwenden Sie einen Pan-Ubiquitin-Antikörper.
    3. Um alle polyubiquitinierten Proteine zu erkennen, verwenden Sie einen Ubiquitin-Antikörper, der nicht mit Monoubiquitination kreuzreagiert.
    4. Für die linkagespezifische Polyubiquitination verwenden Sie Antikörper, die Lysin-27, Lysin-48, Lysin-63 und lineare (M1) Polyubiquitination erkennen können.
  2. Um eine Kreuzkontamination zwischen den Entwicklungen zu verhindern, die zu einem falsch positiven oder störenden Bildgebung einer anderen Ubiquitin-Modifikation führen könnte, streifen Membranen zwischen den Entwicklungen mit 0,1 M NaOH für 10 min.
    1. Waschen Sie die Membranen in TBS mit 0,1% Tween zweimal für 10 min und reblockieren (mit jedem Blockierungsmittel wird im Western Blot-Protokoll bevorzugt).
    2. Inkubieren Sie die Membran mit dem sekundären Antikörper und entwickeln Sie sich neu, um zu bestätigen, dass die Membran von primären und sekundären Antikörpern ordnungsgemäß entfernt wurde.
    3. Empfohlen: Für die erfolgreiche Entwicklung verschiedener Ubiquitin-Antikörper ohne Kontamination verwenden Sie fluoreszierende oder Nahinfrarot-Bildgebungssysteme. Dies kann oft eine Übertragung zwischen Antikörpern verhindern.
  3. Einige ubiquitin Western Blot Bilder werden Spalten von unterschiedlichen Bändern (wie M1) bieten, während andere ein abschmierendes Muster mit wenigen oder gar keinen klaren Linien erzeugen (gemeinsam mit K48). Zur Quantifizierung der abgebildeten Ubiquitin Western Blots, zeichnen Sie eine Box um die Säule, die die gesamte molekulare Standards Leiter erweitert.
    1. Passen Sie die Box nach oben (oder unten) an, wenn sich die Ubiquitinfärbung über die gesamte Leiter erstreckt; Dies ist bei Lysin-48-Modifikationen üblich und variiert stark in subzellulären Fächern.
    2. Subtrahieren Sie den Hintergrund, der als mittlere optische Dichte des Hintergrunds berechnet wird, der die Säule auf allen Seiten unmittelbar umgibt.

Ergebnisse

Mit dem hier beschriebenen Verfahren wurden kernnukleare, zytoplasmatische und synaptische Fraktionen aus der lateralen Amygdala des Rattenhirns (Abbildung1) entnommen. Die Reinheit der einzelnen Fraktionen wurde durch Western Blotting bestätigt, wobei Antikörper gegen Proteine untersucht wurden, die im Lysat angereichert oder erschöpft werden sollten. In der ersten Hemisphäre, auf der eine grobe synaptische Fraktion gesammelt wurde, war das postsynaptisc...

Diskussion

Hier zeigen wir eine effiziente Methode zur Quantifizierung von Veränderungen der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in verschiedenen subzellulären Kompartimenten im selben Tier. Derzeit sind die meisten Versuche zur Messung subzellulärer Aktivitätsänderungen des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf ein einziges Fach pro Probe beschränkt, was dazu führt, dass Experimente wiederholt werden müssen. Dies führt zu erheblichen Kosten und Verlusten an Tierleben. Unser Protokoll lindert dieses Problem, indem es Hemisphären spa...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Start-up-Fonds des College of Agricultural and Life Sciences und des College of Science an der Virginia Tech unterstützt. T.M. wird vom George Washington Carver Program an der Virginia Tech unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTAFisher15575020Various other vendors
20S Proteasome Activity KitMillipore SigmaAPT280Other vendors carry different versions
ATPFisherFERR1441Various other vendors
Beta-actin antibodyCell signaling4967SVarious other vendors
Beta-tubulin antibodyCell signaling2128TVarious other vendors
BioTek Synergy H1 plate readerBioTekVATECHH1MT3Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanolFisherICN19024280Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactoneMillipore SigmaL7035Various other vendors
Cryogenic cupFisher033377BVarious other vendors
DMSODMSOD8418Varous other vendors
DTTMillipore SigmaD0632Various other vendors
GlycerolMillipore SigmaG5516Various other vendors
H3 antibodyAbcamab1791Various other vendors
HEPESMillipore SigmaH3375Various other vendors
Hydrochloric acidFisherSA48Various other vendors
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021Various other vendors
K48 Ubiquitin AntibodyAbcamab140601Various other vendors
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Referenzen

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