Generazione di paesaggi chimici dinamici e controllati per studiare il comportamento microbico

Riepilogo

Viene presentato un protocollo per la generazione di paesaggi chimici dinamici mediante fotolisi all'interno di configurazioni microfluidiche e millifluidiche. Questa metodologia è adatta per studiare diversi processi biologici, tra cui il comportamento motile, l'assorbimento di nutrienti o l'adattamento alle sostanze chimiche dei microrganismi, sia a livello di singola cellula che di popolazione.

Abstract

Dimostriamo un metodo per la generazione di impulsi chimici controllati e dinamici, dove il chemoattractant localizzato diventa improvvisamente disponibile su microscala, per creare micro-ambienti per esperimenti microbici chemiotassi. Per creare impulsi chimici, abbiamo sviluppato un sistema per introdurre le fonti di amminoacidi quasi istantaneamente mediante fotolisi di amminoacidi in gabbia all'interno di una camera microfluidica polidimetilsiloxana (PDMS) contenente una sospensione batterica. Abbiamo applicato questo metodo al batterio chemiotattico, Vibrio ordalii, che può scalare attivamente questi gradienti chimici dinamici mentre viene tracciato dalla microscopia video. Gli amminoacidi, resi biologicamente inerediti ('ingabbiati') dalla modifica chimica con un gruppo di protezione fotoriamo, sono uniformemente presenti nella sospensione ma non sono disponibili per il loro rilascio improvviso, che si verifica in punti di tempo e spazio definiti dall'utente mediante un fascio LED climatizzato vicino all'UV-A. Il numero di molecole rilasciate nell'impulso può essere determinato da una relazione di calibrazione tra il tempo di esposizione e la frazione disidratazione, dove lo spettro di assorbimento dopo la fotolisi è caratterizzato dall'utilizzo della spettroscopia UV-Vis. Una membrana in policarbonato nanoporoso (PCTE) può essere integrata nel dispositivo microfluidico per consentire la rimozione continua da parte dei composti non in gabbia e dei supporti esauriti. Un legame forte e irreversibile tra la membrana PCTE e la struttura microfluidica PDMS si ottiene rivestindo la membrana con una soluzione di 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) seguita dall'attivazione al plasma delle superfici da legare. Un sistema controllato dal computer può generare sequenze definite dall'utente di impulsi in luoghi diversi e con intensità diverse, in modo da creare paesaggi di risorse con prescritta variabilità spaziale e temporale. In ogni paesaggio chimico, è possibile ottenere la dinamica del movimento batterico su scala individuale e il loro accumulo a livello di popolazione, consentendo così la quantificazione delle prestazioni chemiotattiche e i suoi effetti sulle aggregazioni batteriche in ambienti ecologicamente rilevanti.

Introduzione

I microbi si basano sulla chemiotassi, il processo di rilevamento dei gradienti chimici e di modifica della motilità in risposta^1,per navigare nei paesaggi chimici, avvicinarsi a fonti di nutrienti e ospiti e sfuggire a sostanze nocive. Questi processi di microscala determinano la cinetica su macroscala delle interazioni tra i microbi e il loro ambiente^2,3. I recenti progressi nella microfluidica e nelle tecnologie di microfabbricazione, tra cui la litografia morbida^4,hanno rivoluzionato la nostra capacità di creare microambienti controllati in cui studiare le in....

Protocollo

1. Fabbricazione del dispositivo microfluidico per l'esperimento singolo impulso chimico

1. Progettare il canale utilizzando un software CAD (Computer-Aided Design) e stamparlo su una pellicola trasparente per creare la maschera fotografica (Figura 1A).
2. Fabbricare il maestro con litografia morbida (in condizioni di camera pulita).
   1. Pulire un wafer di silicio (4 pollici) in rapida successione con acetone, metanolo e isopropanolo, quindi asciugare con azoto. Cuocere il wafer in forno a 130 gradi centigradi per 5 min.
   2. Posizionare il wafer al centro di uno spin-coater e versare su-8 photores....

Risultati

Abbiamo usato i dispositivi microfluidici e millifluidici (Figura 1) per studiare i profili di accumulo batterico in condizioni di nutrienti dinamiche. Le traiettorie batteriche sono state estratte da video registrati acquisiti mediante microscopia a contrasto di fase della dinamica di dissipazione dell'accumulo di una popolazione batterica a seguito di un impulso chimico rilasciato dalla fotolisi (Figura 2 e Figura 3). Mediando mil.......

Discussione

Questo metodo consente ai ricercatori di studiare la chemiotassi batterica sotto gradienti controllati e dinamici in dispositivi micro e millifluidi, consentendo l'acquisizione di dati riproducibili. La creazione quasi istantanea di impulsi chimici su microscala mediante fotolisi mira a riprodurre i tipi di legumi nutritivi che i batteri incontrano in natura da una serie di fonti, ad esempio la diffusione diffusa dei pennacchi dietro le particelle marine che affondano²⁵, o il nutriente che si diff.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line	VWR-CH	390-0384	to bake 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	to clean the wafer and microchannels
Hot plate	VWR-CH	444-0601	to bond the microchannels
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscope glass slide	VWR-CH	631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	with motorized stage
MNI-Glutamate	Tocris Bioscience	1490	>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment	Stratasys		Objet30 3D printer
Mold printing service	3D Printing Studios	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	to calibrate the uncaging
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane	Sterlitech	PCT0447100	0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish	VWR-CH	25373-100	bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale	VWR-CH	611-2605	to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla	Oxford Instruments		for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt	Instant Ocean	Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Used to design the mold
Spectra X light engine	Lumencolor		for LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Syringe Needle	Agani	A228	from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dual Syringe Pump
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Mold Material