Chiarire e imaging Candida albicans Biofilms

Riepilogo

Per visualizzare e quantificare le caratteristiche interne dei biofilm Candida albicans, prepariamo campioni intatti fissi che vengono chiariti dalla corrispondenza dell'indice di rifrazione. Quindi, la microscopia ottiva di sezionamento può essere utilizzata per ottenere dati immagine tridimensionali attraverso l'intero spessore del biofilm.

Abstract

Il fungo microbico Candida albicans può subire un cambiamento dalla colonizzazione commensale alla virulenza che è fortemente correlata con la sua capacità di passare dalla crescita di lievito-forma alla crescita dell'hyphal. Le cellule che iniziano questo processo diventano aderenti alle superfici e l'una all'altra, con il conseguente sviluppo di una colonia di biofilm. Questo si verifica comunemente non solo sulle superfici del tessuto mucosale nelle infezioni da lievito, ma anche su impianti medici come cateteri. È risaputo che le cellule del biofilm sono resistenti ai farmaci antifungini e che le cellule che versano dal biofilm possono portare a pericolose infezioni sistemiche. I biofilm vanno da fortemente traslucidi a opachi a causa dell'eterogeneità refrattiva. Pertanto, i biofilm fungini sono difficili da studiare con la microscopia ottica. Per visualizzare le caratteristiche strutturali, cellulari e subcellulari interne, chiariamo i biofilm intatti fissati per scambio di solventi graduale a un punto di corrispondenza ottimale dell'indice di rifrazione. Per i biofilm di C. albicans, si ottengono sufficienti chiarimenti con salicilato di metile (n - 1.537) per consentire la microscopia confocale dall'apice alla base in biofilm 600 m con poca attenuazione. In questo protocollo di visualizzazione illustreremo la refractometria di contrasto di fase, la crescita di biofilm di laboratorio, la fissazione, la colorazione, lo scambio di solventi, l'impostazione per la microscopia a fluorescenza confocale e i risultati rappresentativi.

Introduzione

Candida albicans è un fungo microbico che è tipicamente commensale negli esseri umani. È di fondamentale interesse per i biologi perché l'organismo ha più morfologie. Ad esempio, in risposta a determinati segnali o fattori di stress ambientali, le cellule in erba nella forma di lievito passeranno alla crescita filamentosa come catene di settizi di cellule altamente allungate note come hyphae. La transizione è importante come esempio di espressione fenotipica di un passaggio tra un programma di espressione genica unicellulare e multicellulare. Allo stesso modo, C. albicans è di interesse biomedico perché l'organismo è un patogeno opportunistico ben noto. È responsabile di infezioni da lievito mucosale come il mughetto (candidiasi orale), le infezioni genitourinarie e una causa di infezioni invasive o sistemiche pericolose nei pazienti immunologicamente indeboliti.

Il potenziale di virulenza di questo organismo è strettamente collegato ai suoi morfotipi multipli e ad altri aspetti della sua versatilità genetica^1,2,3^,4. L'estensione del tubo di Germ, la prima fase visibile della transizione alla crescita dell'hyphal, avviene con sufficiente rapidità per consentire alle cellule C. albicans inghiottite di uscire dai fagociti e quindi sfuggire a una fase iniziale della risposta immunitaria cellulare dell'ospite⁵. Inoltre, la filamentazione è preceduta e accompagnata da un grande aumento dell'aderenza da cellula a cellula e da cellula a superficie che è dovuto all'espressione regolata di diverse classi di proteine della parete cellulare note come adhesins^6,7,8,9. In un'ampia varietà di condizioni, la combinazione di aderenza e filamento si traduce in un drastico passaggio dalla crescita planctonica e unicellulare alla crescita coloniale associata alla superficie che forma un biofilm. C. albicans biofilm possono sviluppare su comuni dispositivi medici impiantati come cateteri venosi. Infezioni diffuse possono verificarsi quando tali biofilm iniziano a germogliare dalle cellule lievito-forma e versarli nel sangue circolante. Diversi studi hanno dimostrato che le cellule di biofilm sono più resistenti ai farmaci antifungini rispetto alle cellule planctoniche^10,11, che possono essere dovute in parte al metabolismo abbassato¹². Inoltre, l'elevata aderenza complessiva di un biofilm può fornire l'ancoraggio necessario per una crescita invasiva efficiente di ife nel tessuto ospite¹.

Il chiarimento ottico dei biofilm di C. albicans mediante la corrispondenza dell'indice refrattivo ha avuto un impatto importante sulla nostra capacità di visualizzare la struttura di questa comunità microbica e scoprire le relazioni tra espressione genica e fenotipo. I biofilm coltivati in laboratorio su superfici di prova sotto mezzo di coltura liquida per 48 h appaiono come un rivestimento biancastro abbastanza denso e abbastanza denso da essere opaco (Figura 1). Pertanto, molte caratteristiche fenotipiche interessanti del biofilm sono nascoste alla vista. I biofilm di tipo selvatico da 24 h coltivati in YPD, RPMI-1640, o Spider medium a 37 gradi centigradi, con 48 h di biofilm che spesso raggiungono i 500 m. L'opacità è dovuta alla dispersione della luce, che deriva dall'eterogeneità refrattiva: la parete cellulare fungina è più refrattiva del mezzo circostante e il citoplasma leggermente più refrattivo rispetto alla parete cellulare. L'elevata densità ottica risultante di un biofilm nativo oscura tutte le strutture profonde più di 30 m se viste con un microscopio convenzionale o addirittura con uno scanner confocale (Figura 2). Tuttavia, un grande grado di chiarimento può essere ottenuto infiltrandosi in biofilm fissi con un liquido ad alto indice di rifrazione che corrisponde approssimativamente alla refrattività dei principali costituenti cellulari. Dopo il chiarimento, l'imaging a risoluzione submicron può essere effettuato tramite microscopia confocale attraverso l'intero spessore di quasi tutti i biofilm C. albicans ¹³. Negli esemplari di tipo selvatico, è facile vedere che i biofilm sono costituiti da lunghe ife impigliate, grappoli di cellule di lievito germogliato-forma o cellule pseudoigienico, spazi vuoti, e una certa quantità di matrice extracellulare. Inoltre, i biofilm sono generalmente stratificati, mostrando differenze morfologiche spazialmente varianti nel tipo di cellula, nella densità cellulare e nella presenza di cellule in erba o ramificate. Molte variazioni in una o più di queste caratteristiche sono state osservate nei biofilm sviluppati da ceppi mutanti^14,15. Inoltre, i ceppi di reporter mostrano differenze spaziali in situ nell'espressione genica^16,9,13. Il sorprendente grado di chiarimento ottenibile con questo approccio relativamente semplice e poco costoso permette anche di vedere che molti biofilm includono hyphae apiliche e hyphae invasive basali che si estendono a distanze millimetriche.

In questo protocollo di visualizzazione, dimostriamo il fissaggio, l'etichettatura, il chiarimento e l'imaging di un biofilm C. albicans utilizzando un semplice marcatore a parete cellulare come macchia. L'origine dell'attuale versione del protocollo è la migliore chiarezza che abbiamo osservato quando i biofilm fissi di formaldeide sono stati infiltrati con il 97% del methacritilla glicole (GMA), che è stato poi polimerizzato per incorporare il biofilm in una plastica dura con un indice di refrattivo moderatamente elevato (n - 1,49). Abbiamo quindi utilizzato la microscopia a contrasto di fase convenzionale e una serie di liquidi di riferimento dell'indice di rifrazione per determinare con maggiore precisione il punto di inversione del contrasto (massima trasparenza) del biofilm (Figura 3). Per C. albicans biofilm questo si è verificato vicino a n - 1.530, che era sorprendentemente alto dato che una struttura proteica densa come la cheratina per capelli è solo leggermente più refrattiva (1.54–1.55). Anche se è all'estremità superiore della gamma ottimale in Figura 3, abbiamo adottato salicilato di metile (olio di wintergreen, n - 1.537) nel protocollo attuale perché è stato a lungo utilizzato come agente chiarificante per la microscopia in embriologia e istologia, ha bassa tossicità e bassa pressione del vapore, e ha dato ottimi risultati nelle nostre prove utilizzando moderata ottica di immersione dell'olio-NA.

Quattro punti dovrebbero essere fatti qui:

(1) Con poche eccezioni, la situazione ideale in microscopia è che l'indice di rifrazione del campione dovrebbe essere uguale all'indice di rifrazione del fluido di immersione obiettivo^17,18,13. Per gli studi di imaging tridimensionale (3D) in cui è necessaria una messa a fuoco profonda, questo è sempre importante.

(2) Il nostro risultato sperimentale per la compensazione ottimale (n - 1,525–1,535) è leggermente superiore rispetto agli oli di immersione standard (n - 1,515, 1,518) e quindi viola il punto (1), e quindi introduce una fonte di aberrazione sferica quando si utilizzano ottiche di immersione dell'olio standard. Una soluzione a questo problema è l'uso di un obiettivo progettato per un indice di immersione nella gamma superiore. A causa di una rinascita dell'interesse per l'imaging di esemplari cancellati, gli obiettivi speciali con la correzione necessaria stanno diventando disponibili. L'altra soluzione è quella di regolare l'indice del mezzo chiarificatore fino a 1.515 o 1.518 con l'aggiunta di una piccola quantità di butanolo (n - 1.399) per prestazioni ottimali di immersione dell'olio, e accettare la chiarezza leggermente degradata.

(3) La microscopia di biofilm intatti (e di altri campioni su questa scala) richiede una distanza di lavoro significativa per ospitare lo spessore del campione. Si tratta di una considerazione pratica importante. Una lunga distanza di lavoro limita l'ottica a un'apertura numerica moderata (NA - 0,6–1,25), che limita la risoluzione ma limita anche la gravità dell'aberrazione sferica.

(4) L'indice di rifrazione ottimale per il chiarimento può essere diverso per altri tipi di campioni fissi. Le spettre devono essere testate di conseguenza utilizzando il contrasto di fase e una serie di liquidi di riferimento dell'indice di rifrazione, come illustrato nella Figura 3.

Protocollo

1. Crescita delle culture di Biofilm

INFORMATIVA: Candida albicans è un agente patogeno umano. In alcune istituzioni, la cultura di questo organismo richiede il contenimento di BSL-2.

1. Streak fuori ceppo selezionato su un lievito extract-peptone-dextrose (YPD) agar piastra e crescere 48 h a 30 .
2. Selezionare singole colonie dalla piastra per inoculare 5 mL di yPD medio in 15 mL tubi di coltura per la crescita aerobica durante la notte (rotatore carosello, 52-55 giri/) a 30 .
3. Determinare la densità cellulare utilizzando una diluizione da 40 a 50 volte della coltura durante la notte. Calcolare il fattore di diluizione necessario per portare la densità cellulare a 3 x 10⁶ cellule/mL per la substrato di silicone, o 0,6–1,2 x 10⁶ celle /mL per superfici di vetro di copertura trattate con concanavalin-A (ConA) o agglutinina del germe di grano (WGA) (vedi Discussione).
4. Per la crescita del biofilm in una piastra da 12 pozze(Figura 1),erogare 2,0 mL di filamento medio sterile in ogni pozzo e scaldare la piastra a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata. Una varietà di supporti indurrà filamentazione, più fortemente ad una temperatura elevata (37 gradi centigradi) e con siero aggiunto. Siero bovino fetale (FBS) è raccomandato. I media consigliati sono YPD, Spider-Mannitol o RPMI-1640.
5. Con una pinzetta sterile, mettere un substrato preparato in ogni pozzo nella piastra riscaldata e sloggiare le bolle. Aggiungere l'inoculum della coltura notturna per raggiungere la densità di cellule raccomandata nel passaggio 1.3 in ogni pozzo. Un pozzo senza inoculo funge da vuoto visivo e da controllo contro la contaminazione.
6. Posizionare la piastra su un miscelatore orbitale da 60 giri/m in un'incubatrice d'aria umida di 37 gradi centigradi per 90 min per consentire l'adesione alle cellule. Dopo 90 min, rimuovere le cellule medie e non attaccate, lavare con mezzo sterile o fosfato-buffer (PBS), e mettere substrati inoculati in piatti di coltura o un'altra piastra multiwell contenente mezzo di filamento preriscaldato. Con piastre multiwell, è molto conveniente utilizzare una seconda piastra per la fase di lavaggio e una terza piastra con 2,0 mL di mezzo preriscaldato per pozzo per ricevere il substrato inoculato lavato. Sterilizzare le pinzette prima di ogni trasferimento.
7. Riportare la piastra all'incubatrice ambiente-aria umidificata da 37 gradi centigradi e far crescere i biofilm fino a 48 h con miscelazione orbitale da 60 giri per l'aerazione. Ci dovrebbe essere poca crescita planctonica in ogni coltura a meno che il biofilm in via di sviluppo non stia spargendo cellule a forma di lievito. Un biofilm coltivato in questo modo è mostrato Figura 1.

2. Elaborazione di campioni per l'imaging

ATTENZIONE: I fissativi dell'aldeide sono volatili e pericolosi. Preparare diluizioni fissative in un cappuccio di fumi, non in un armadietto di biosicurezza. Non mettere fissativi negli incubatori utilizzati per le cellule vive. Lavora con fissativi diluiti in piatti coperti in un cofano o in una zona ben ventilata. Smaltire i fissativi e le soluzioni di lavaggio post-fissaggio come rifiuti pericolosi.

1. Preparare nuovo fissativo, 4% formaldeide o paraformaldeide in PBS, opzionalmente con fino al 2% glutaraldeide. La formalina diluita al 4% può essere utilizzata per lavori di routine.
   NOT: La glutaraldeide in particolare aumenterà l'autofluorescenza a banda larga e potrebbe attenuare la fluorescenza di tag esprimibili come dTomato.
2. Togliere il supporto di coltura dal campione e sostituirlo con PBS per diluire le proteine del siero, o trasferire il biofilm sul suo substrato in PBS, per alcuni minuti.
3. Trasferire il campione in fissativo e impostare il piatto coperto su un miscelatore orbitale lento per 20 min. Estendere il periodo di tempo durante l'elaborazione di campioni più spessi (vedere Discussione). A ogni piatto deve essere aggiunto un volume fissativo sufficiente per immergere tutta la crescita del biofilm, compresi quelli sui lati interni del piatto.
4. Rimuovere il fissativo e riempire il piatto con PBS per lavare il fissativo residuo. Smaltire il fissativo come rifiuti pericolosi. Ripetere diversi fusti a breve termine, poi lava più a lungo per consentire al fissativo residuo di diffondersi dal biofilm o dal blocco di agar. Il periodo di lavaggio dipende dal tempo consentito per la fissazione (vedere Discussione).
5. La quantità necessaria di macchia dipenderà dalla massa del biofilm. Rimuovere tutti i biofilm dalle aree non campione del piatto di coltura prima della colorazione, o trasferire l'esemplare fisso in un nuovo piatto prima della colorazione. Non lasciare che il biofilm si scarichi o si asciughi.  Tienilo immerso in PBS.
6. Aggiungere la macchia al piatto (vedere Discussione) e impostare il piatto coperto su un mixer orbitale lento durante la notte (vedi Discussione). Proteggere dalla luce.
7. Al mattino, rimuovere la soluzione di colorazione e riempire il piatto con PBS per diluire la macchia non associata. Impostare i piatti sul mixer orbitale lento per destarein per diverse ore.

3. Protocollo di chiarimento: Biofilm su Impermeant Substrata

1. I biofilm chiarificati sono difficili da discernere visivamente. Pertanto, se lo si desidera, contrassegnare un lato di ogni substrato con un graffio per designare il lato per l'inoculazione.
2. Utilizzare pipette Pasteur lunghe etichettate per tutti i successivi rifiuti e trasferimenti di solventi per evitare la contaminazione incrociata dei solventi.
3. Utilizzando una pinzetta, trasferire il biofilm fisso da PBS a 5 mL di 50:50 PBS:metanolo in una fiala di vetro da 20 mL con il biofilm rivolto verso l'alto. Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di 1 min per 5 min (vedere Discussione).
4. Rimuovere il solvente in una bottiglia di scarto, essendo prudente per evitare il contatto tra la pipetta e il biofilm, o il biofilm e fiala. Riempire delicatamente con 3 mL di metanolo pulito. Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di 1 min per 3 min.
5. Rimuovere il solvente in una bottiglia di scarto e riempire immediatamente con 5 mL di metanolo. Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di 1 min per 5-10 min. Rimuovere il solvente nella bottiglia di scarto e riempire immediatamente con 3 mL di metanolo. I biofilm spesso sembrano più opachi a questo punto rispetto al loro aspetto iniziale.
6. Togliere il solvente alla bottiglia di scarto e riempire immediatamente la fiala con 5 mL di 50:50 metanolo: salicilato di metil. Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di 1 min per 5-10 min. Il biofilm dovrebbe essere semitrasparente in questo solvente misto.
7. Rimuovere il solvente in una bottiglia di scarto. Riempire delicatamente la fiala con 3 mL di salicilato di metilico pulito (MS). Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di 1 min per 3 min.
8. Togliere il solvente alla bottiglia di scarto e riempire immediatamente con 5 mL di MS pulito. A questo punto, il biofilm dovrebbe essere trasparente. Rimuovere il solvente nella bottiglia di scarto e riempire immediatamente la fiala con 3 mL di SM pulito. Il biofilm elaborato è stabile in questo solvente.
9. Per i biofilm su agar (vedi Discussione) estendere tutti i periodi di tempo di scambio per consentire la diffusione dell'acqua e del solvente attraverso l'agar. I periodi di tempo necessari possono essere stimati utilizzando un microscopio dissetante a bassa potenza con illuminazione darkfield per visualizzare l'avanzamento del solvente nell'agar. Il protocollo raggiunge un buon chiarimento e nessun grave effetto di restringimento quando viene utilizzato il 2% di agar, ma l'agar chiarificato si condensa se spremuto durante la manipolazione con una pinzetta. Si raccomanda l'uso di una spatola.

4. Configurazione dell'imaging per la microscopia confocale

1. I seguenti passaggi sono per l'uso di un microscopio invertito. Utilizzare un piatto a prova di solvente che abbia un fondo di vetro di copertura per tenere il campione invertito sullo stadio del microscopio (vedere Discussione).
2. Preparare i distanziali per il supporto del campione invertito. Utilizzare rettangoli piccoli tagliati da vetrini al microscopio (1.000 m di spessore), bicchieri di copertura (170 m) o anelli di silicone da 13 mm (330 m, vedere Tabella dei materiali), che possono essere impilati in base alle esigenze. Presoak gli anelli in salicilato di metile per 1 h per ridurre al minimo la deriva di messa a fuoco a causa del gonfiore.
3. Per un biofilm su un quadrato in silicone di qualità medica, invertire il quadrato (cioè, abbassare il biofilm) e impostarlo su un distanziale in una pozza di salicilato metilico nel piatto (Figura 2). Assicurarsi di evitare eventuali bolle sotto il campione.
4. Montare il piatto saldamente sul palco del microscopio e rendere l'olio immerso contatto con l'obiettivo (vedi Discussione).
5. Regolare la quantità di SM nel piatto in modo che il menisco tenga saldamente il campione sul distanziale dalla tensione superficiale. Posizionare una goccia di MS sopra il substrato quadrato invertito per ridurre la dispersione della luce dalla finitura opaca e coprire il piatto con una piastra di vetro per limitare l'evaporazione. Attendere alcuni minuti che il campione si stabilisca sui distanziali prima dell'imaging.
6. Utilizzare la luce trasmessa per ispezionare visivamente il campo visivo e individuare la posizione di messa a fuoco corrente rispetto alle regioni apicali e basali del biofilm invertito. Impostare il condensatore illuminante apertura numerica (INA) al minimo (chiudere l'iride del condensatore) per aumentare il contrasto, altrimenti il biofilm chiarificato sarà quasi invisibile. Al termine, spegnere la sorgente luminosa trasmessa.
7. Passa alla fluorescenza confocale e imposta i limiti inferiore e superiore dello stack di immagini a messa a fuoco seriale necessario per coprire il biofilm. La spinta verso l'alto, che è consigliata, mostrerà prima le cellule sloggiate che si sono depositate sul vetro di copertura e le ife apicali molto lunghe che si trovano sul vetro. All'estremità superiore della sequenza, le cellule fondatrici dovrebbero essere viste aderenti al substrato alla base del biofilm. Impostare il diametro del foro stenopeico, la spaziatura dei pixel nel piano dell'immagine e l'incremento del passo di messa a fuoco utilizzando i criteri generali descritti nella discussione.

Risultati

Biofilm come quello in Figura 1 sono fortemente traslucidi opaco, ma sono regolarmente chiariti e immagine utilizzando il protocollo di cui sopra. La figura 2 mostra la forte attenuazione della fluorescenza con profondità di messa a fuoco in un biofilm fisso in PBS, rispetto allo stesso biofilm dopo la corrispondenza dell'indice. Come illustrato nella Figura 3, utilizzando solventi ernivamente ernivi dell'aumento dell'indice di rifrazione, è possibile stimare rapidamente il massimo per maggiore chiarezza. Questo viene perfezionato dalla microscopia a contrasto di fase convenzionale per trovare il punto di contrasto minimo (massima trasparenza). È evidente che questa soluzione ottimale non si ottiene mediante la corrispondenza omogenea degli indici. Questo perché le strutture subcellulari differiscono leggermente nell'indice di rifrazione. In questo caso, l'inversione del contrasto si è verificata nella parete cellulare in un indice di solvente leggermente inferiore rispetto al citoplasma. Per i biofilm albicani Candida, l'ottimale si verifica vicino a n - 1.530. I biofilm mutanti da 48 h e cak1 DX in Figura 4A avevano uno spessore di 500 m, ma le cellule di lievito alla base erano immagini quasi nitide come le cellule apicali. Analogamente, come illustrato nella figura 4C, l'attenuazione della fluorescenza non è stata fortemente correlata alla profondità di messa a fuoco. Figura 5 mostra hyphae invasive in agar, centinaia di micrometri sotto un biofilm di superficie. Le ifhae invasive mature producono costantemente lieviti in erba laterale ai setti nella catena dell'hyphal, dando origine a sottocolonie di cellule simili a lieviti a intervalli regolari lungo un'hypha invasiva.

Figura 1: colture di biofilm prima del chiarimento. Un biofilm di 24 h cresciuto da un isolato di un ceppo efg1 integrato di C. albicans in una piastra di 12 pozzetti su un quadrato di silicone in RPMI-1640 mezzo liquido integrato con 10% FBS. Il vuoto sterile è in ben C4.  L'insetto mostra una sezione trasversale tagliata di biofilm di tipo selvatico di 96 ore coltivata in una piastra di 6 pozze su una base di agar da 3,75 mm nello stesso mezzo che mostra ife invasive. Entrambi i pannelli sono alla stessa scala. Barra di scala 2,0 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: miglioramento dell'imaging profondo in base alla corrispondenza dell'indice. La figura mostra proiezioni di immagini laterali di pile di immagini confocali da un biofilm di tipo selvaggio da 48 h che è stato fissato e macchiato con ConA-Alexafluor 594. (A) L'esemplare è stato immaginato in PBS utilizzando un obiettivo di immersione diretta dell'acqua 63x 1.0 NA. L'attenuazione era grave ad una profondità di messa a fuoco di 30 m. (B) Dopo il chiarimento mediante i passi del protocollo 3.3–3.8, lo stesso biofilm è stato immagine in salicilato di metile con attenuazione minima utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio 40x 0,85 NA. Dopo la sottrazione dello sfondo e la proiezione laterale degli stack di immagini 3D, i dati 40x sono stati ridimensionati spazialmente in modo da corrispondere ai dati 63x per il confronto. (C) Diagramma schematico che mostra il montaggio invertito del campione cancellato (dalla SM) trasferendosi alla SM in un piatto di alluminio anodizzato nero con un fondo di vetro di copertura cementato (vedi Discussione). Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: la refractometria di contrasto fase mostra l'inversione di contrasto delle funzionalità cellulari nella gamma di corrispondenza ottimale dell'indice. I biofilm fissi sugli occhiali da copertura sono stati scambiati dalla PBS al metanolo, poi in xilene (n - 1,496). Questi biofilm sono stati poi scambiati uno ciascuno da xilene in una serie di liquidi di riferimento dell'indice di rifrazione (Serie E, Cargille Laboratories, vedi Tabella dei materiali)e sono stati esaminati visivamente fianco a fianco per determinare la gamma di indici dando la massima trasparenza. (pannello superiore) Immagini a contrasto di fase: un biofilm è stato scambiato in serie tra lo xilene e uno stretto insieme di liquidi di riferimento in tale intervallo. Dopo ogni scambio, lo stesso campo è stato trasferito e visto attraverso un vetro di copertura utilizzando un 40x 0.85 NA Ph2 olio fase di contrasto obiettivo e Ph2 condensatore. Tutte le immagini sono state registrate con la stessa impostazione della lampada e l'esposizione della fotocamera per visualizzare con precisione i cambiamenti. Con l'aumento dell'indice, l'inversione di contrasto è vista per la prima volta a n - 1,530 per la parete cellulare, seguita dal citoplasma a n - 1.535. Barra della scala: 10 m. (pannello inferiore) Grafico che mostra la luminosità minima media del biofilm al punto di massima trasparenza. Una forte dispersione di luce all'interno del biofilm fa sì che la luminosità media superi il campo vuoto. Le celle isolate appaiono più scure del campo vuoto, fino all'inversione di contrasto nell'intervallo 1.530–1.535. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini profonde di biofilm mutanti e selvatici di tipo C. albicans. Un ceppo di tipo selvaggio (GIORNO185) e un ceppo correlato alla proteina chinasi correlata al ciclo cellulare sono diminuiti(cak1 DX)¹⁴ sono stati coltivati a 37 gradi centigradi per 48 h su substrato di silicone nel mezzo liquido YPD. I biofilm sono stati fissati, macchiati con ConA-Alexafluor 594, e chiarito utilizzando il protocollo di scambio solvente in salicilato metilico. La microscopia confocale 3D ha mostrato che entrambi i biofilm erano spessi 500 m. I dati dell'immagine sono stati convertiti in formato a 32 bit in ImageJ o Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ o http://fiji.sc), quindi elaborati utilizzando la funzione Sottrai sfondo con un raggio della palla rotante di 50 pixel, la soglia per impostare i pixel negativi su zero, la riattivazione e l'utilizzo della proiezione di intensità massima per produrre viste laterali. (A) Proiezioni assiali e laterali: il biofilm di tipo selvaggio è cresciuto fino a raggiungere uno spessore di 502 m come si vede nella proiezione della vista laterale della pila di immagini confocali a 558 piani. Barra della scala: 100 m. (pannelli a sinistra) proiezioni assiali a 40 piani dall'apice (in alto) alla base (in basso) mostrano la variazione nei tipi di cellule in diversi strati del biofilm. Questo esempio ha mostrato una caratteristica struttura di tipo selvatico: le cellule aderenti alla base danno origine a ife che salgono in una densa zona centrale di cellule pseudoofili e simili a lieviti. Sopra la zona media, le ife riemersero e diedero origine a grappoli di lievito in erba. Le lunghe ife osservate nella zona apicale si estendevano probabilmente al mezzo di coltura nel biofilm vivente, ma si ripiegavano sulla superficie del biofilm durante la lavorazione del campione. Il biofilm cak1 DX è cresciuto fino a raggiungere uno spessore di 500 m, come si vede nella proiezione a vista laterale della pila di immagini a 556 piani. Questo mutante, che è noto per subire una crescita filamentosa in assenza di stress^{induzione 14}, ha prodotto un'architettura drammaticamente diversa. Come si vede sia nella vista laterale che nelle proiezioni assiali (pannelli a destra), molte cellule ramificate hanno dato origine a escrescenze radiali. (B) Esempi di ifae ramificate all'interno del biofilm cak1 DX. Barra della scala: 10 m. (C) L'attenuazione della fluorescenza con profondità nel biofilm di tipo selvaggio chiarificato è stata quantificata mascherando i pixel di sfondo, quindi calcolando il segnale digitale medio per tutti i pixel non di sfondo in ogni piano dell'immagine. Ad eccezione delle ife apicali che sono brillantemente etichettate dalla lectina, non c'era una forte tendenza di attenuazione con profondità di messa a fuoco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Hyphae invasiva in agar. C. albicans hyphae in un biofilm di superficie penetrerà un substrato di agar a distanze millimetriche (vedi Figura 1). Dopo il chiarimento, le strutture invasive possono essere viste verso il basso attraverso il biofilm, o verso l'alto dal lato inferiore dell'agar. Quest'ultimo richiede una maggiore distanza di lavoro. In alternativa, dopo la fissazione, ma prima dello scambio di macchie e solventi, l'agar può essere tagliato verticalmente con un bisturi o una lama di rasoio in lastre da 1-2 mm che poi possono essere girate su un lato e immagine direttamente nella vista laterale dopo la colorazione e il chiarimento. Questa procedura è consigliata. In questa proiezione di un campo visivo di 213 m, è stata utilizzata una scala di colori arcobaleno per codificare la posizione assiale su una gamma di 75 m: le caratteristiche blu sono vicine e le caratteristiche rosse sono più profonde nel piano della pagina. Questa visione mostra che le lunghe radici di ifae di lievito laterale a intervalli semiregolari che danno origine a sottocolonie. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I progressi nella microscopia a fluorescenza nel sezionamento ottico, nella risoluzione, nella velocità, nell'elusione o nella compensazione dell'aberrazione, nell'acquisizione multicanale e nella potenza di calcolo, hanno causato una rinascita nell'imaging di campioni intatti. Per gli esemplari fissi, sia i metodi di chiarimento e di espansione classici che nuovi hanno avuto un impatto importante^19,20,21,22^,23,24. In questo caso, abbiamo applicato un approccio rapido e semplice di corrispondenza dell'indice basato sul solvente per studiare la struttura dei biofilm fungini fortemente traslucidi in opaco.

I protocolli precedenti sono stati testati con una serie di campioni. Nel nostro laboratorio Candida albicans i biofilm sono più spesso coltivati su quadrati da 14 mm tagliati da un foglio di gomma medicale in silicone (vedi Tabella dei materiali). Questo substrato viene utilizzato perché la crescita sul PDMS (poli-dimetilsiloxane) sommersa nel mezzo di coltura liquida è stata stabilita come un importante modello in vitro per le infezioni associate agli impianti medici, in particolare i cateteri che abitano. Le cellule sollecitate che hanno avvistato il filamento aderiscono rapidamente a superfici non polari come la PDMS. In pratica, i quadrati usati che sono stati puliti e risterilizzati in un'autoclave (ciclo secco) danno i biofilm più coerenti per qualsiasi ceppo particolare. I biofilm sono anche comunemente coltivati su bicchieri di copertura, in piatti di coltura di fondo di vetro di copertura, in piatti in polistirolo di grado batteriologico standard, e su agar. Poiché le cellule di C. albicans non aderiscono bene al vetro, gli occhiali di copertura devono essere trattati con una lectina che legherà i polisafini della parete cellulare. Applichiamo 40 L di 1 mg/mL ConA o WGA in acqua sterile su ogni superficie di coverslip. Dopo l'essiccazione, gli occhiali di copertura vengono trattati con 40 - L dell'1% di glutaldeide per 3 min per incrociare la proteina in una pellicola insolubile. Vengono poi lavati con acqua distillata sterile per rimuovere la lectina fissativa e qualsiasi solubile e asciugata all'aria. Se necessario, gli occhiali o i piatti di copertura trattati vengono risterilizzati sotto una lampada UV germicida per 10 min.

Lo spessore dell'oggetto influenzerà i periodi di incubazione richiesti nei protocolli. La diffusione fissativa in un biofilm da 300 m richiede diversi minuti per l'equilibrate. Questo periodo di tempo aumenta con lo spessore del quadrato del campione e deve essere esteso a un'ora o più per biofilm molto spessi o campioni di blocchi di agar che possono essere spessi 2-3 mm. Il periodo di tempo di acchiognimento per la colorazione dipende anche dallo spessore del campione descritto per il fissaggio e il lavaggio. Tuttavia, poiché le lectine si diffondono più lentamente dei fissativi a basso MW, specialmente all'interno di un gel di agar, la colorazione deve essere estesa durante la notte. Lo stesso dovrebbe essere fatto per il lavaggio della macchia in eccesso.

Le macchie di vario tipo possono essere incorporate nei protocolli. Usiamo una macchia a parete cellulare per l'imaging strutturale, più comunemente Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) o una lectina con tag coloranti come ConA-Alexafluor 594 o WGA-Alexafluor 594. L'attenzione dovrebbe essere prestata alla valenza della proteina. Il tetramerO ConA può causare il crosslink di ife altamente flessibili nella regione apicale di un biofilm. Questo è meno evidente con il dimero WGA. Le specificità canoniche di questi marcatori sono Calcofluor per la chitina, ConA per i residui di mansidui e WGA per i residui di acido X-acetyl-D e sialic.

Poiché il protocollo di scambio di solventi è classificato da PBS o acqua attraverso il metanolo in salicilato metilico, i contenitori di campioni devono essere resistenti ai solventi. Il salicitore di metile (MS) ammorbidisce rapidamente i plastici in polistirolo e ammorbidisce lentamente altre materie plastiche. I gradini del protocollo fino all'uso del metanolo pulito possono essere effettuati in plasticware, ma a quel punto del protocollo generalmente passiamo alle fiale di vetro standard da 20 mL con tappi a vite resistenti ai solventi. Le fiale sono convenienti per biofilm su substrati quadrati in silicone, perché i quadrati possono essere raccolti e trasferiti utilizzando pinzette sottili. Inoltre, una fiala può essere drenata e riempita con il quadrato piatto appoggiato sulla superficie curva interna in modo che il biofilm non contatti il vetro. Il substrato dovrebbe essere biofilm-up quando è immerso nella fiala verticale. Le fiale sono eccellenti per lo stoccaggio di campioni a lungo termine.

Nel protocollo di chiarificazione, passaggi di scambio di solventi più graduati riducono al minimo il rischio di deformazione del campione a causa degli effetti di miscelazione del solvente. Per velocità e convenienza nel protocollo di base, ci sono quattro passaggi: 1) passo 3.3, PBS a 50:50 PBS:metanolo; 2) passaggi 3.4 e 3.5, PBS:metanolo per il metanolo pulito, 3) passo 3.6, metanolo pulito a 50:50 metanolo:MS; e 4) i passaggi 3.7 e 3.8, metanolo:MS per la smuna ordinata. Tuttavia, poiché l'acqua e la SM sono quasi immiscibili, è essenziale che tutta l'acqua sia spostata dal metanolo prima dell'introduzione di qualsiasi SM. Allo stesso modo, poiché il metanolo è altamente volatile, è importante spostando tutto il metanolo da parte della SM. l'evaporazione del metanolo residuo causerà variazioni dell'indice refrattivo all'interno del campione. All'interno della sequenza di quattro fasi, si consiglia di ripetere il secondo e il quarto passo aggiungendo un altro cambiamento di solvente pulito, o anche una terza modifica. Per gli esemplari particolarmente fragili, i cambiamenti dei solventi potrebbero essere formulati in piccoli passi percentuali.

Con gli esemplari di agar block, i gradini 3.4 e 3.5 (metanolo pulito) possono causare la comparsa di cristalli di sale all'interno dell'agar a causa dell'insorgarsibilità dei sali PBS residui nel metanolo. Ciò può essere evitato utilizzando acqua distillata (DW) nel primo passo solvente misto al posto della PBS per diluire i sali durante lo scambio di acqua:metanolo. La sequenza alternativa di scambio di solventi per biofilm fissi consiste quindi di questi passaggi: 1) fase 3.3, trasferire il campione da PBS in 50:50 DW:metanolo (consentire tempi supplementari per la diffusione attraverso l'agar); 2) passo 3.4, trasferire il campione da 50:50 DW:metanolo nel metanolo pulito (ripetere 2x con metanolo come nel passo 3.5); 3) passo 3.6, trasferire l'esemplare dal metanolo alle 50:50 metanolo:salicila di metile; e 4) passo 3.7, trasferire il campione da 50:50 metanolo:MS a SM pulito (ripetere 2x con SM come nel passo 3.8).

Poiché il salicilato di metile ammorbidisce rapidamente i plastici in polistirolo, utilizziamo un piatto di alluminio anodizzato con un fondo di vetro di copertura per contenere il biofilm chiarificato sullo stage di un microscopio invertito. Il vetro di copertura è tenuto in posizione utilizzando cemento ottico UV-curing (Norland Optical Adhesive #61, vedi Tabella dei materiali). A condizione che la SM venga rimossa alla fine della giornata lavando il piatto con isopropanolo seguito da acqua saponata e risciacquo, il vetro di copertura cementato servirà per molti mesi.

La selezione obiettiva delle lenti è di fondamentale importanza nell'imaging su larga scala di campioni chiarificati a causa dell'importanza di ridurre al minimo l'aberrazione sferica e la necessità di una distanza di lavoro sufficiente. Abbiamo esperienza con tre obiettivi in questi studi. Nella configurazione invertita del microscopio, utilizziamo un olio obiettivo a lunga distanza di lavoro, a apertura numerica moderata (NA) immerso sotto il vetro di copertura con il biofilm immerso nel salicilato metilico nel piatto sopra il vetro di copertura. La maggior parte del nostro lavoro è stato fatto con un obiettivo acromatico della serie Universal, tipo 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, utilizzato con un adattatore focale di lunghezza negativo 160 mm per la compatibilità nominale conconiugato infinito (IC). Questo obiettivo è stato originariamente progettato per la visualizzazione immersa nell'olio attraverso vetrini al microscopio da 1,5 mm con una distanza di lavoro di 0,35 mm²⁵. Se utilizzato con un vetro di copertura standard (0,17 mm), la distanza di lavoro è molto maggiore: 1,5 x 0,35–0,17 , 1,68 mm e 1.680 m. Usiamo anche un nuovo obiettivo multi-immersione zeiss, tipo 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat con una distanza di lavoro superiore a 540 m, con la correzione di immersione impostata sul lato alto di 'olio'. Questo obiettivo è altamente corretto e produce un'immagine superba. Su un supporto al microscopio verticale, abbiamo usato un nuovo obiettivo multi-immersione Nikon, tipo MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat con una distanza di lavoro superiore a 5.000 m (5 mm), anche con la correzione dell'immersione impostata sul lato alto di 'olio' (n - 1.518). Anche se questo obiettivo ha un NA inferiore rispetto agli altri, ha il vantaggio di essere direttamente immersibile in salicilato metilico.

Per ottimizzare l'acquisizione dei dati in termini di velocità e risoluzione, le impostazioni del microscopio confocale idealmente dovrebbero soddisfare densità di campionamento Nyquist trasversali e assiali¹⁸. Utilizzando i criteri convenzionali, impostare il diametro del foro stenopeico confocale nominalmente su 1 unità Airy. In coordinate ingrandite,

d_P (M) - 1,22 x ingrandimento x (lunghezza d'onda di emissione in m) / NA

Il campionamento trasversale (spaziatura pixel) non deve superare il limite di risoluzione di Abbe (1/2) x. Nelle coordinate dello spazio oggetto,

(lunghezza d'onda di emissione in nm) / (4 NA)

Il campionamento assiale (incremento di messa a fuoco) non deve superare la larghezza di banda assiale inversa,

(indice di immersione) x (lunghezza d'onda di emissione in nm) / (NA²)

Il sistema ottico confocale espande la larghezza di banda del microscopio e affina la risoluzione trasversale e assiale di almeno 1/2.

Per l'obiettivo 40x 0,85 NA che utilizziamo più spesso, vedere la Tabella 1 per i risultati di queste formule per una lunghezza d'onda di emissione di 600 nm (Alexa Fluor 594).

	Formula	x 1/ 2	set (tipico)
dP (m)	34,5 m	-	25 o 50 m
x, y	176 nm	125 nm	161 nm
z (z)	1200 nm	848 nm	900 nm

Tabella 1: diametro del foro stenopeico confocale, campionamento trasversale e valori di campionamento assiale per una lunghezza d'onda di emissione di 600 nm.

Utilizzando uno scanner confocale del disco rotante con queste impostazioni e un campo di scansione di 1.392 x 1.040 pixel, i dati dei campioni di biofilm possono essere acquisiti con velocità e risoluzione ragionevoli. Tipici stack di immagini 3D a colore singolo esecano da 0,35 a 1,55 GB.

Il supporto di chiarimento in un ampio utilizzo copre un intervallo di indici di rifrazione significativo. Con l'illuminazione di darkfield e l'ispezione visiva, abbiamo scoperto che i biofilm fissi di C. albicans erano più trasparenti al di sopra di n.5. Questo è stato perfezionato dalla microscopia a contrasto di fase a n - 1.530–1.535. Per una serie di motivi pratici, usiamo il salicilato di metile (n - 1.537) come solvente di corrispondenza dell'indice finale. Anche se lo scambio di solventi comporta il rischio di deformazione dei campioni o di altri artefatti, le cellule in esemplari fissi e chiari hanno dimensioni del corpo cellulare simili, diametro dell'ipfa e dimensioni di lunghezza intersettale come campioni vivi.

Sono possibili molte variazioni nel processo di scambio di solventi (ad esempio, utilizzando un solvente transitorio diverso o un solvente finale diverso). Il metanolo è stato scelto per la sua alta polarità e la sua rapida diffusione, ma l'etanolo è stato indicato per preservare meglio la resa quantistica delle proteine fluorescenti rosse (RFP)²⁶ come solvente transitorio. Il salicilato di metile è stato selezionato per il suo indice, la polarità moderata, la bassa pressione del vapore e la compatibilità con molte macchie, coloranti e proteine fluorescenti. Tuttavia, un solvente finale con indice leggermente più basso, o una miscela di salicilato di metile e un solvente indice inferiore, come il butanolo, può servire meglio.

Inaspettatamente, la capacità di vedere attraverso un biofilm rivela non solo le sue caratteristiche interne stratificate, ma aiuta anche a visualizzare l'origine di strutture estese come lunghe ifae apicali lunghe e invasive e ipie basali invasive su alcuni substrati. La virulenza opportunistica nei C. albicans dipende dalla sua versatilità genetica (cioè il passaggio alla crescita dell'hyphal, l'upregulation del substrato cellulare e l'aderenza cellulare, la generazione di osmoitti per il germogliamento e l'allungamento delle cellule e l'uso di sostanze nutritive alternative). L'estensione della hyphal consente l'evasione di singole cellule C. albicans da cellule immunitarie fagocitiche, ma è anche essenziale per l'invasione. L'adesione del biofilm e l'entanglement dell'ifapale sembrano fornire l'ancoraggio superficiale necessario alle ife per invadere in modo efficiente un substrato. Quando tale substrato è tessuto ospite, può provocare una maggiore virulenza.

L'imaging di biofilm intatti consente un gran numero di esperimenti informativi che utilizzano ceppi di reporter per l'espressione genica, i substrati del tessuto modello e l'inclusione di altri organismi come i batteri presenti nei biofilm naturali. Anche nel caso più semplice dell'imaging puramente strutturale con una macchia a parete cellulare, vengono rivelati fenotipi in situ che possono essere quantificati e analizzati geneticamente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biohazardous waste receptacle
Biosafety cabinet with germicidal UV lamp
Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol)
Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate
Distilled water			DW
Distilled water, sterile
Ethanol, absolute			EtOH
Fetal bovine serum (FBS), sterile
Fixative waste bottle in secondary containment
Formaldehyde 20% in water, ampules	Electron Microscopy Sciences
Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37%	Electron Microscopy Sciences
Fume hood
Glutaraldehyde 25% in water, ampules	Electron Microscopy Sciences
Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes
Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates
Isopropanol 70%			iPrOH 70%
Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W	Cole-Parmer Scientific		for curing NOA-61 cement
Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick	Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/		Non-reinforced medical grade silicone sheeting
Methanol 99.9%			MeOH
Methyl salicylate 99%			MS
Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets	Millipore Corp.	SX0001301
Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61	Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com	NOA-61
Orbital mixer, benchtop
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile
Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment)	Cargille Laboratories, https://cargille.com	Series E	Cedar Grove, NJ 07009, USA
RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile
Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner	Fisher Scientific Co.	03-341-25H	for specimen processing and storage
Solvent waste bottle in secondary containment
Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate
Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)
YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)