Strategisk screening och karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex för framgångsrik kristallisering

Nyckeln till att bestämma kristallstrukturer av membranproteinkomplex är provets kvalitet före kristallisering. I synnerhet är valet av tvättmedel kritiskt, eftersom det påverkar både stabiliteten och monodispersity av komplexet. Vi fastställde nyligen kristallstrukturen hos ett aktivt tillstånd av bovin rhodopsin kopplat till ett konstruerat G-protein, mini-G_o, vid 3.1 Å-upplösning. Här beskriver vi proceduren för att optimera beredningen av rhodopsin-mini-G_o-komplexet. Dark-state rhodopsin var beredd i klassiska och neopentyl glykol (NPG) rengöringsmedel, följt av komplex bildning med mini-G_o under ljusexponering. Stabiliteten i rhodopsin bedömdes av ultraviolett-synlig (UV-VIS) spektroskopi, som övervakar reconstitution i rhodopsin av ljuskänsliga ligand, 9-cis retinal. Automatiserad storlek-uteslutning kromatografi (SEC) användes för att karakterisera monodispersity av rhodopsin och rhodopsin-mini-G_o komplex. SDS-polyakrylamid elektrofores (SDS-PAGE) bekräftade bildandet av komplexet genom att identifiera en 1:1 molar förhållandet mellan rhodopsin och mini-G_o efter färgning gelen med Coomassie blå. Efter korsvalidering av alla dessa analysdata eliminerade vi olämpliga tvättmedel och fortsatte med det bästa datatvättmedlet för storskalig beredning och kristallisering. Ett ytterligare problem uppstod från heterogenitetn en N-glykosylering. Heterologously-uttryckt rhodopsin observerades på SDS-SIDA för att ha två olika N-glycosylated populationer, vilket förmodligen skulle ha hindrat kristalllogenesis. Därför testades olika deglycosylationenzymer, och endoglycosidase F1 (EndoF1) producerade rhodopsin med en enda art av N-glycosylation. Med denna strategiska pipeline för att karakterisera proteinkvalitet optimerades beredningen av rhodopsin-mini-G_o-komplexet för att leverera kristallstrukturen. Detta var bara den tredje kristallstrukturen i en GPCR-G protein signalering komplex. Detta tillvägagångssätt kan också generaliseras för andra membranproteiner och deras komplex för att underlätta provberedning och strukturbestämning.