Поколение и количественная характеристика функциональных и поляризованных желчных эпителиальных кист

Резюме

Трехмерные (3D) клеточные системы являются актуальными моделями для изучения органогенеза. Предлагается метод на основе гидрогеля для производства желчных кист и их характеристики. Этот протокол распутывает барьеры 3D-характеристики, с помощью простого и надежного метода оценки эффективности образования кисты, размеров и проверки их функциональности.

Аннотация

Холангиоциты, эпителиальные клетки, которые выстраиваются желчных протоков в печени, контролировать образование желчи и модификации. В последние двадцать лет, в контексте заболеваний печени, 3-мерные (3D) модели на основе холангиоцитов появились такие как кисты, сфероиды, или трубчатые структуры для имитации топологии тканей для органогенеза, моделирования заболеваний, и исследования скрининга наркотиков. Эти структуры были в основном получены путем встраивания холангиоцитов в гидрогель. Основная цель состояла в изучении самоорганизации путем устранения эпителиальной полярности, функциональных и морфологических свойств. Тем не менее, очень немногие исследования сосредоточены на эффективности формирования кисты. В этом случае эффективность часто измеряется на основе изображений одной плоскости. Функциональные анализы и структурный анализ проводятся без представления потенциальной неоднородности распределения кисты, возникающей в результате гидрогелевой полимеризации неоднородности и побочных эффектов. Поэтому количественный анализ, когда он проводится, не может использоваться для сравнения с одной статьей на другую. Кроме того, эта методология не позволяет сравнивать 3D потенциал роста различных матриц и типов клеток. Кроме того, нет никакого упоминания об экспериментальном устранении неполадок для иммуностимуляторных кист. В этой статье мы предоставляем надежный и универсальный метод, чтобы показать, что первоначальное распределение клеток связано с неоднородным вертикальным распределением образования кисты. Клетки холангиоцитов, встроенные в гидрогель, следуют с анализом стеков вдоль глубины гидрогеля в течение 10 дней. С помощью этого метода, надежная кинета эффективность образования кисты и роста получается. Мы также представляем методы оценки полярности кисты и секретоорийной функции. Наконец, дополнительные советы по оптимизации иммуностимуляторов предоставляются для того, чтобы ограничить кист коллапс для визуализации. Этот подход может быть применен к другим исследованиям культуры 3D клеток, открывая тем самым возможности для сравнения одной системы с другой.

Введение

За последние три десятилетия область исследований in vitro продвинулась к системам 3D-культуры. Ряд протоколов появились для культивирования клеток в 3D как сфероиды или агрегаты в присутствии или отсутствии эшафота / матрицы, в капле, в агитации, в микрофлюидных устройств, или^{плавающей 1}. Использование методов 3D культуры доказало свои преимущества перед 2-мерными (2D) культурами, особенно для эпителиальных клеток, которые были показаны для самоостроения в 3D структурах, называемых кистами или acini. В этом случае клетки образуют монослой, окружающий люмен, где клетки приобретают свой полный эпителиальный фенотип с улучшенными физиологическими....

протокол

1. Поколение кист

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть выполнен с любым типом гидрогеля, если гелеобразование позволяет встраивание клеток.

1. Гидрогель покрытие
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное гидрогельное покрытие камерного слайда является критическим шагом, чтобы избежать образования 2D-клеточных слоев на дне хорошо, что может помешать последующей визуализации кисты и ухудшить расчет эффективности образования кисты.
   1. Чтобы обеспечить однородность раствора геля, оттаивать гидрогель при 4 градусов по Цельсию в одночасье (O/N).
   2. Предустановка пипетки советы на льду или O / N при -20 градусов по Цельсию и 8-хорошо камеры сл....

Результаты

Формирование и характеристика кист
Системы культуры 3D клеток являются важным инструментом для изучения органогенеза и моделирования^{заболеваний 25}. К сожалению, большинство из этих методов являются качественными или использовать внутреннюю количественную оце?.......

Обсуждение

Для изучения органогенеза и поддержания 3D клеточных структур, различные ткани были смоделированы, используя различные клеточные происхождение, но и различные типы внеклеточных матриц, включая синтетические гидрогели^8,9,10,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000020
100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000046
1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000062
1X PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-094
200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma-Aldrich	T5516	NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL
Acetic acid	VWR	20104-298	0.02N final
Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707439
Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707404
Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707430
Antibiotic Antimicotic Solution (100X)	Sigma-Aldrich	A5955	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Bovine pituitary extract	Thermo Fisher Scientific	13028-014	NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153	1:1000 dilution
Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)	Thermo Fisher Scientific	11905-031	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Collagen high concentration, rat tail	Thermo Fisher Scientific	354249	50 µg/mL final concentration
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	NRC complete medium final concentration = 1X
E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal	Thermo Fisher Scientific	PA5-32178	1:400 dilution
Eclipse TE300 inverted microscope	Nikon		imaging
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	NRC complete medium final concentration = 0.32 mM
Fetal calf serum	Thermo Fisher Scientific	10270-106	NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution
Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)	Sigma-Aldrich	F6057
Formaldehyde 16% (W/V)	Thermo Fisher Scientific	28906	4% (W/V)
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	16210-064	1:10 dilution
Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)	Hamamatsu		imaging
Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	B1155	5 µg/mL final concentration
IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32733	1:500 dilution
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n			Open source image processing software
Insulin-Transferrin-Selenium (100X)	Thermo Fisher Scientific	51300-044	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
L-Glutamine (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030-024	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	356231	4:10 dilution
NIS Elements software version 4.50.00	Nikon		image acquisition and display
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-035	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2)	Nikon
Prolong Gold Antifade Reagent	Thermo Fisher Scientific	P36931
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170	20 µg/mL final concentration
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	16.2 nM final concentration
Sir-Actin / Verapamil kit	Spirochrome	SC001	10 µM final concentration
Soybean trypsin inhibitor	Thermo Fisher Scientific	17075-029	NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL
Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	22363547
Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811E
Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	11926955
Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	7200886
Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	553913
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	5:100 dilution
Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)	Thermo Fisher Scientific	353108
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	5:1000 dilution
Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054	1X
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	5:10000 dilution
Vitamin (100X)	Thermo Fisher Scientific	11120-037	NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi	Clinisciences	80826