ラットにおける骨髄間葉系幹細胞の単離と培養

要約

本稿では、ラット下顎骨から骨髄間葉幹細胞を単離、栽培、選別、同定するための骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせた方法を紹介する。

要約

ここでは、実験要件に対して多数の高品質細胞を迅速に得るために、インビトロで下顎骨髄間葉系幹細胞(mBMSC)を単離・培養するための効率的な方法を紹介します。mBMSCは、優れた自己再生能力と多系統分化能力により、将来的に頭蓋顔面疾患や頭蓋顎顔面再生の場合の組織工学細胞としての治療用途に広く使用される可能性があります。したがって、mBMSCs を大量に取得することが重要です。

本研究では、骨髄を下顎骨から洗い流し、原発mBMSCを骨髄付着栽培全体で単離した。さらに、CD29+CD90+CD45−mBMSCを蛍光細胞選別により精製した。第2世代の精製mBMSCは、骨芽細胞、有形細胞、軟骨細胞への分化においてさらなる研究と潜在能力を示す目的で使用された。このin vitroモデルを利用して、多くの増殖性mBMSCsを得ることができ、生物学的特性の研究、その後の微小環境への反応、およびmBMSCsの他の用途を促進することができる。

概要

骨髄間葉系幹細胞(BMC)は、強い増殖能力および多系統分化電位^{1、2、3、4}を示す骨髄由来の非造血幹細胞^である。確かに、BMCは発見されて以来、骨組織工学と再生の理想的な候補と考えられてきました。何年もの間、腸骨の紋章や脛骨や大腿骨などの長い骨は、頭蓋顔面再生のためのBMSCの最も一般的な供給源であった。しかし、下顎骨BMC(mBMSC)などの顔面BMSCsは、異なる胚起源および発達パターンなどの長い骨BMSCとのいくつかの違いを示す。下顎骨は神経摘出胚層の神経堤細胞から生じ、内在性骨軟化を受け、軸および付加的骨格は中胚体からであり、内因性骨化を受ける。さらに、臨床観察および実験動物研究は、一貫して、オロフェイシャルと腸骨紋^{BMC5、6、7、8}の間に機能的な違いがあることを示している。報告によると、下顎骨、上顎骨、歯槽骨などの頭蓋顔面骨に由来するBmSCは、軸骨および付属骨からのものよりも優れた増殖、寿命、および分化能力を示した^。mBMSCは、したがって、ケルビズム、顎腫瘍、顎骨の骨粗鬆症、および歯周組織欠損^10、11、12などの頭蓋顔面疾患の将来の治療用途に好まれるリソースであると考えられる。前臨床実験における治療の可能性を理解するためには、インビトロでmBMSCを迅速に単離・培養する方法を確立することが不可欠である。

本研究では、骨髄全体の付着とフローサイトメトリー選別により精製mBMSCsを得ることを目的とした。ラット下顎骨の解剖学的形態は、マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)および組織学的切片を通して明確に観察され、下顎骨の骨膜骨が切歯髄腔と歯槽骨の間であることを示した。骨蓋骨から骨髄を洗い流して下顎骨細胞を得たが、この方法で培養した細胞は純粋なmBMSCではなく、骨、脂肪および内皮細胞^13、14の細胞のような不確実なポテンシーおよび多様な系統を有する複数のタイプの細胞から成る可能性が高い。細胞浄化の次のステップは特に重要であった。フローサイトメトリーは、細胞表面タンパク質の組み合わせを認識して細胞をフィルターし、間葉系幹細胞の濃縮に広く採用されています。細胞の均質性はフローサイトメトリーの主な利点であるが、プロセスは細胞の生存率を決定せず、細胞収量が制限される可能性がある。本研究では、骨髄全体の付着から得られたP0 mBMSCをフローサイトメトリーで選別し、高純度で増殖能力の高いmBMSCsを得た。

本研究では、骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせて、ラット下顎骨BMSCの分離、培養、分化のための再現性と信頼性の高いプロトコルを紹介する。関連分野の研究者が利用できる、信頼できる便利な方法です。

プロトコル

本論文の動物実験手順はすべて、上海交通医科大学上海交通医院動物ケア委員会によって承認された。

1. 準備

1. 実験には5週齢のオスのスプレイグ・ドーリーラットを2匹使用してください。
2. 針ホルダー、ピンセット、ハサミを含むすべての器具を高温で殺菌するか、75%エタノールに10分間浸漬します。
   注:エタノール浸漬は、細胞の損傷を避けるために長すぎないようにしてください。
3. 培養培地を事前に準備し、その構成を 表1に示す。以下に説明する各培地を補足する。
   1. α-MEM培地の調製(10%FBS):10%の胎児ウシ血清および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを用いた最小必須培地アルファ(α-MEM)を補う。
   2. 骨形成分化培地の調製:骨形成分化基底培地を10%胎児ウシ血清、1%グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.20%アスコルビン酸、1%βグリセロリン酸および0.01%デキサメタゾンを添加する。
   3. 骨形成誘導培地の調製:70%α-MEM培地(10%FBS)と30%の骨形成分化培地を混合する。
   4. アディポ原性分化培地Aの調製:10%の胎児ウシ血清、1%グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.20%インスリン、0.10%IBMX、0.10%ロシグリタゾンおよび0.01%デタゾンを有する付加的な分化基底液培地。
   5. アディポ原性分化培地Bの調製:10%の牛血清、1%のウシ胎児血清、1%のペニシリン連鎖球菌および0.20%インスリンを有する付加的分化基底培地を補足する。
   6. 軟骨発生分化培地の調製:0.01%デキサメタゾン、0.30%アスコルビン酸、1%ITS、0.10%ピルビン酸ナトリウム、0.10%プロリンおよび1%TGF-β3を有するコンドロゲン分化基底培地を補足する。
      注: 骨形成分化培地は、構成後1ヶ月以内に使い切る必要があります。構成された軟骨発生分化培地の有効期間は12時間である。

2. ラットmMCの分離と栽培

注: 細胞の生存率を維持するために、すべての実験操作を氷上で可能な限り実行する必要があります。

1. ラット下顎の収穫
   1. CO₂ 窒息によって2匹の5週齢の雄のスプレイグ・ドーリーラットを安楽死させる。実験を進める前に、動物の呼吸が止まっていることを確認してください。
   2. これらのラットを3分間75%エタノールを含むビーカーでリンスする。
   3. ネズミを清潔な煙のフードの中に入れて下顎を収穫します。
      注:使用前に30分間紫外線照射でヒュームフードを殺菌してください。
   4. ラットをサピーヌの位置に置きます。両側性アングルスオリスから下切歯を有する唯一の可動骨である下顎骨の後部領域に皮膚およびブハネーター筋肉を切開する。
      注:明確な操作フィールドを得るためにアングルスの両側に2cmの切開を行うことをお勧めします。
   5. 両親指で上顎および下顎切歯を反対方向に押し出してラットの口を開き、下顎に付着した下顎歯を露出させる。
   6. 頬筋と角筋と下顎下の下の境界に取り付けられた腱を完全に切断します。
      注:筋肉の緊張の欠如のために、このステップ中に下顎の移動性の増加が観察されます。
   7. 下顎後歯を押し、両側の顆がはっきりと露出するまで前後に回転します。
      注:このステップは、人工的にラットの口を開いて、コンディレを外す可能性のある最大限の範囲で行います。下顎骨は両側の顆を通して頭蓋骨に接続されているので、顆の暴露は頭蓋骨と下顎骨の間の切断につながる。
   8. 下顎骨の体を頭蓋骨から分離します。
   9. 濡れたガーゼを使用して、骨表面の付着性の軟組織を洗浄します。
   10. 生存率を維持するために、氷の上に予冷された最低必須培地α(α-MEM)またはリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で満たされた10cmの無菌ガラス皿に骨を入れます。
2. mBMSCsの分離と栽培
   1. 下顎体から最初の臼歯の間縁に沿って前骨を切り落とす。骨髄腔を露出させるために、3番目の大臼歯の遠位縁に沿って、コラコイドと顆を含む下顎のラムスを取り除きます。
   2. 10 cmの無菌ガラス皿に10 mLのα-MEM(10%FBS)を充填します。
   3. 1 mL シリンジを使用して、α-MEM培地を吸引します。注射針を骨髄腔に挿入すると、骨髄を皿に繰り返し洗い流す。骨が白くなるまで、骨の前後側から骨腔を少なくとも3回洗い流す。
      注:これは、ラット下顎骨の骨髄腔が長い骨ほど明白ではなく、針を挿入するための適切な点を経験的に決定する必要があるため、最も重要なステップです。上記の実験サンプルはすべて、細胞の生存率を維持するために氷の上に保存する必要がありますので、操作時間は2時間以下でなければなりません。
   4. 洗い流された細胞を含む培地を15mL遠心管に移し、4°Cで 800xg の遠心分離機を5分間移動させます。上清を捨てます。
   5. セルを3 mLのα-MEMで再中断します(FBSが10%)。新しい10cm培養皿に細胞をプレートし、5%CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
   6. 培養3日目にこれらの細胞の形態変化と成長を確認してください。非接着性細胞および組織断片を含む培地を除去する。10 mLの新鮮なα-MEM(FBS 10%)をそっと加えます。
   7. 培養7日後、P0 mBMSCは70~80%の合流に達した。
3. フローセルの並べ替え
   注: P0 mBMSC は、フローセルのソートによって、典型的に同定され、主に精製されました。
   1. 吸引し、培養液を捨て、その後PBSで皿を洗います。PBS を破棄します。
   2. 0.25%のトリプシンを1 mL加え、0.02%EDTAを皿に入れます。37°Cで5分間細胞を消化し、2mLのα-MEM(10%FBS)を加えて反応を止めます。
   3. 細胞懸濁液を15mL遠心チューブに移し、800 x g で遠心分離機を5分間移動します。
   4. 遠心分離後、PBSの120 μL(10%FBS)で細胞を再懸濁します。
   5. これらの細胞懸濁液を、CD16/CD32に対して1μLの抗体を4°Cで15分間ブロックします。
   6. 細胞懸濁液100μLを新しいマイクロ遠心分離管に移し、CD45に対するフィコエリスリン(PE)共役抗体で細胞を染色し、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)-CD90およびAllophycocyanin(APC)抗体に対して^{13°Cで13°13°}の間にCD29抗体を結合させた抗体この実験で使用した抗体の濃度を表2に示す。他の20μLの細胞懸濁液を無染色陰性対照として使用してください。
   7. その後、チューブを800 x g で5分間遠心し、懸濁液を捨て、細胞をPBSの0.5 mL(10%FBS)で再懸濁します。
   8. 分析前に10分間0.01mg/mL DAPIの10 μLを加えます。
   9. 遠心分離管に配置された40nmフィルターを使用して細胞をフィルター処理します。
   10. 蛍光活性化細胞ソーター上の細胞を分析する。パネルを次のように設定します。まず、DAPI^-細胞、次にCD29+CD90+CD45-を標的mBMSCsとして選択した細胞にゲートして、細胞総数から死んだ細胞を除去する。
   11. ソートされたCD29+CD90+CD45-細胞を3mLのα-MEM(10%FBS)をあらかじめ用意した15 mL遠心管に集める。
   12. チューブを800 x g で5分間遠心します。収集バッファーを取り外し、1 mL の新鮮な α-MEM (10% FBS) を追加してセルを再中断します。その後、6 cmの文化皿に入れてお皿に入れます。

3. コロニー形成能力

注: このステップは mBMSCs の区分能力をチェックするために実行されました。¹⁵

1. この実験では、2番目のパッセージmBMSCs(P2)を選択します。細胞合流が80%から90%に達したら、細胞を6ウェルプレートの連続勾配で再播種して、そのクローン増殖能力を評価する。
   注:1ウェルあたり1 x 10² から1 x 10³ 細胞の勾配を設定することをお勧めしますが、人間または動物起源の異なる細胞株の最終的な希釈は経験的に決定されました。
2. α-MEM(10%FBS)の細胞を、かなりの数のコロニー形成ユニットが光顕微鏡下で見られるまで約2週間培養した。3日ごとに培地をリフレッシュしてください。
3. 培地を吸引して廃棄し、一度に5分間PBSでウェルを2回洗浄する。次に、各ウェルに4%パラホルムアルデヒド溶液を加え、少なくとも10分間固定します。
4. パラホルムアルデヒドを取り出し、PBSでウェルを2回リンスします。
5. 結晶紫色染色液で細胞を染色し、37°Cで約10分間インキュベートします。
   注:染色時間は、所望のシェードが達成されるまで適切に調整されました。
6. 染色液を取り出し、蒸留水でサンプルを洗浄して反応を止めます。
7. 実体顕微鏡下での画像と、少なくとも50個の細胞から成る散乱細胞コロニーを数える。

4. mMC の多系統分化

注: P2 mBMSCs は、特に説明がない限り、その後の実験に使用されました。

1. mBMSCsの骨形成誘導
   1. 上記の手順で mBMSCs をダイジェストにします。1 2 mL α-MEM(10%FBS)を補った12ウェルプレートの^2.5x 10 5 /cm² の密度で細胞をシードします。
   2. 細胞合流が60〜70%に達すると、培地を30%骨形成誘導培地に変更する。α-MEM(10%FBS)を陰性対照として細胞を培養し、2日ごとに培地を変化させる。
      注:骨形成中に多数のカルシウム結節が出現した後、骨芽細胞が浮遊するのを防ぐために、2日ごとに中量媒体交換に媒体交換パターンを変更することをお勧めします。
   3. 7日間培養した後、アルカリホスファターゼ染色^16,17によるこれらの細胞の石灰化を評価する。
   4. 培養培地を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定します。1ウェルあたり1 mLのPBSを3分間2回使用して細胞をリンスします。
   5. 次にアルカリホスファターゼ染色液で細胞を染色し、37°Cで10〜30分間インキュベートします。
      注:インキュベーションは、必要な色を得るために室温で一晩行うことができます。
   6. 反応を止めるために蒸留水で井戸を洗います。軽顕微鏡で写真を撮る。赤色素色素顆粒はアルカリホスファターゼ(ALP)活性を表す。
   7. 残りの細胞をさらに7日間培養した後、アリザリン赤染色を行い、細胞のミネラル化能力を評価する。
   8. 10分間^16、18の細胞固定後に0.5%アリザリン赤染色液で細胞を染色する。3~5分後に蒸留水で発泡反応を止めます。
      注:反応時間は、開発した色に応じて延長することができます。
   9. 最後に、培養プレートを光学顕微鏡の下に置き、骨形成染色の効果を観察します。赤い結節は、これらの細胞のカルシウム沈着を示す。
2. mBMSCsのアディポジェニック誘導
   1. P2 mBMSCsを上記の12ウェルプレートにシードします。
   2. ウェルが90%コンフルエントになった後、a.α-MEM培地で培養した細胞(10%FBS)を負の対照として使用して、細胞を培養する。
   3. 2日間の誘導の後、培地Aをウェルから吸引し、各ウェルに1mLのアディポジェニック分化培地Bを加える。
   4. 1日後、培地Bを取り除き、ミディアムAを井戸に戻してサイクルを再開します。培地AとBを用いて細胞を交互に培養する。
   5. 分化培地AとBを3サイクルに交互に適用し、油赤O染色^16、18によってこれらの細胞の脂質生成を検出する。
      注:丸い、大きな脂質の液滴の多くは、さらに2〜3日間分化培地Bでこれらの細胞を培養することによって観察することができます。
   6. 培地を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定します。PBSで細胞を洗い流します。
   7. 油の赤色O染色液で細胞を染色し、37°Cで約3分間インキュベートする。
   8. 染色液を取り除き、蒸留水で井戸を洗います。
   9. 軽顕微鏡での脂質生成を観察します。
3. mBMSCsの軟骨形成誘導
   1. P2 mBMSCsを15 mL遠心分離管に5 x 10⁵/cm 2の密度で入^れました。
   2. チューブを300 x g で5分間遠心します。上清を捨てます。
   3. 0.5 mLの軟骨発生分化培地で細胞を再懸濁する。5分間 300xg で細胞を遠心分離する。
   4. 遠心管のキャップを緩め、37°Cで5%CO2インキュベーターでインキュベートします。2日ごとに培地を更新します。
      注:細胞は24時間後にペレットを開始します。遠心分離管を48時間動かさないのが推奨されます。培地を変える時は細胞ペレットを吸引しないように注意してください。
   5. 21日間の誘導後、4%パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを固定し、続いて脱水、パラフィン埋め込み、切除を行います。
   6. 脱パラフィンと水和後、アルシアブルー溶液中のスライドを少なくとも18、19、20、21分間染色し、蒸留水で洗浄して反応を停止します。写真を光顕微鏡で撮影します。
   7. コラーゲンII型の免疫蛍光染色については、以下の手順を行う。
      1. 脱パラフィンと水和のステップの後、37 °Cで15分間5μg/mLプロテイナーゼKでスライドをインキュベートします。
      2. 37°Cで1時間ブロッキングバッファーにスライドをインキュベートします。
      3. 200μLのブロッキングバッファーに1μLのコラーゲンII抗体をスライドに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。
      4. 翌日、PBSでスライドを2回洗浄し、37°Cで2次抗体を1時間インキュベートします。
      5. スライスを40,6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)で10分間インキュベートします。
   8. 蛍光顕微鏡下で各スライドの写真を撮ります。

5. リアルタイム PCR

1. 市販の試薬に基づいてグアニジウムイソチオシアネートを使用してmBMSCから総RNAを抽出する。
2. 市販のキットを使用して、RNAを相補的なDNAに逆転写します。逆転写の反応条件は、5分間65°C、15分間37°C、15sで85°Cである。
3. 表3に記載されているプライマーを用いて骨形成および脂質生成特異的遺伝子を検出するためにリアルタイムPCRを行 う。 PCR増幅手順は、5sの場合は5分間95°C、40サイクルの場合は30sの場合は60°Cの95°Cである。

結果

このプロトコルを用いて、初期培養後3日目にプレートに接着した細胞の大部分を占めた。典型的には、さらに3〜4日間培養した後、細胞合流率は70〜80%に達した(図1B)。蛍光細胞選別では、DAPI^-CD29⁺CD90⁺CD45^- mBMSCを精製して18,22、P0細胞で約81.1%を占めた(図1C)。

ディスカッション

このプロトコルは、骨髄付着と蛍光細胞選別を組み合わせることによって、ラット下顎骨からBMCを分離する方法を説明する。この方法は、フローセルソーティングによってmBMSCを予備的に精製することができますが、細胞の均質性に対してより高い要件がある場合は、より正確な精製方法が必要になる可能性があります。

現在、mBMSCsの単離に使用される4つの主要な技術?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA（1X）	Gibco	25200072
10cm culture dish	Corning
acutenaculum
Adipogenic differentiation medium	Cyagen biosciences inc.	MUBMX-90031
Alcian Blue	Beyotime Biotechnology
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Alkaline Phosphatase Color Development Kit	Beyotime Biotechnology	C3206
alpha-Minimum essential medium	GE Healthcare HyClone Cell Culture	SH30265.01B
Anti -CollagenII Rabbit pAb	Abcam	ab34712
Antibodies against CD16/CD32
Antifade Mounting Medium with DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody	biolegend inc	102215
Biosafety cabinet	Esco	AC2-4S8-CN
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience	Invitrogen	11-0900-85
Centrifuge	cence	L500
Chondrogenesis differentiation medium	cyagen biosciences inc.
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM880
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
Crystal Violet Staining Solution	Beyotime Biotechnology	C0121
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare HyClone Cell Culture	SH30084.03
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150077
Incubator	Esco	CCL-170B-8
Inverted microscope	olympus	CKX53
Magzol reagent(Trizol reagent)	Magen
micropipettor	Eppendorf
Oil Red O
Osteogenic differentiation medium	cyagen biosciences inc.	MUBMX-90021
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate-buffered saline（1X）	Gibco	20012027
PrimeScript RT Master Kit	TakaRa Bio Inc	RR036A
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
QuickBlock Blocking Buffer	Beyotime Biotechnology	P0260
scissor
SYBR1 Premix	TakaRa Bio Inc
Toluidine Blue	Beyotime Biotechnology
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061