Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Denne protokol viser brugen af en robot platform for mikroinjektion i enkelt neurale stamceller og neuroner i hjernen skiver. Denne teknik er alsidig og tilbyder en metode til sporing af celler i væv med høj rumlig opløsning.
Et centralt spørgsmål i udviklingsmæssige neurobiologi er, hvordan neurale stamceller og progenitor celler danner hjernen. For at besvare dette spørgsmål, man har brug for at mærke, manipulere, og følge enkelte celler i hjernevævet med høj opløsning over tid. Denne opgave er yderst udfordrende på grund af kompleksiteten af væv i hjernen. Vi har for nylig udviklet en robot, der guider en mikroinjektionsnål ind i hjernevæv, når billeder erhvervet fra et mikroskop til at levere femtoliter mængder opløsning til enkelte celler. Robotdriften øger det samlede udbytte, der er en størrelsesorden større end manuel mikroinjektion og giver mulighed for præcis mærkning og fleksibel manipulation af enkelte celler i levende væv. Med dette kan man mikroinject hundredvis af celler inden for en enkelt organotypic skive. Denne artikel viser brugen af mikroinjektion robot til automatiseret mikroinjektion af neurale progenitor celler og neuroner i hjernen væv skiver. Mere generelt kan det bruges på ethvert epitelvæv med en overflade, der kan nås af pipetten. Når den er sat op, kan mikroinjektionsrobotten udføre 15 eller flere mikroinjektioner pr. minut. Mikroinjektionsrobotten på grund af dens gennemløb og versalitet vil gøre mikroinjektion til en stort set ligetil højtydende cellemanipulationsteknik, der skal anvendes i bioengineering, bioteknologi og biofysik til udførelse af enkeltcelleanalyser i organotypiske hjerneskiver.
Denne protokol beskriver brugen af en robot til at målrette og manipulere enkelte celler i hjernevæv skiver, med fokus især på enkelt neurale stamceller og neuroner. Robotten blev udviklet til at løse et centralt spørgsmål i udviklingsmæssige neurobiologi, det er, hvordan neurale stamceller og progenitor celler bidrager til hjernen morfoogenese1,2,3,4,5. For at besvare dette spørgsmål, man har brug for at mærke og spore enkelt neurale stamceller og følge deres afstamning progression over tid at korrelere enkelt celle adfærd med væv morfosse. Dette kan opnås på forskellige måder, fx ved at elektroporere hjernevæv i livmoderen eller ved at mærke enkelt celle ved hjælp af lipofile matricer. Selv om magtfulde, disse metoder mangler præcis enkelt celle opløsning (elektroporation) og / eller muligheden for at manipulere det intracellulære rum (lipofile farvestof). Mikroinjektion i enkelte celler blev udviklet for at overvinde denneudfordring 6,7,8. Under mikroinjektion indsættes en pipette kortvarigt i en enkelt celle i intakt væv under tryk på mikroinject femtoliter mængder reagenser9. Vi har tidligere beskrevet en manuel procedure for mikroinjekting enkelt neurale stamceller i organotypisk væv (Figur 1A)10,11. Mikroinjektion i neurale stamceller er afhængig af brugen af en mikropipette, der indsættes i enkelte neurale stamceller til at injicere en opløsning, der indeholder en fluorescerende farvestof, sammen med andre molekyler af interesse. Den selektive målretning af neurale stamceller opnås ved at nærme sig den udviklende telencephalon via ventrikulær overflade (eller ventrikel, se tegneserie i figur 1A), der dannes af den apikale plasmamembran af aptiske forfædre (tegneserie i figur 1A). Denne proces skal gentages for hver celle, som eksperimentatoren ønsker at injicere. Endvidere er mikroinfektionens succes afhængig af den præcise kontrol af dybden og varigheden af mikropipetteinjektion i vævet. Således, på trods af de unikke fordele, manuel mikroinjektion er yderst kedelig og kræver betydelig praksis til at udføre på rimelig gennemløb og udbytte, hvilket gør denne teknik vanskeligt at bruge på en skalerbar måde. For at overvinde denne begrænsning har vi for nylig udviklet en billedguidet robot, Autoinjector12 (eller microinjection robot), der automatisk kan udføre mikroinjektioner i enkelte celler.
Mikroinjektionsrobotten gør brug af mikroskopiske billedbehandlings- og computersynsalgoritmer til præcist at målrette specifikke steder i 3D-rummet i væv til mikroinjektion (Figur 1B). Mikroinjektionsrobotten kan konstrueres ved at foretage relativt enkle ændringer af et eksisterende mikroinjektionsopsætning. Mikroinjektionsrobottens overordnede skema er vist i figur 1C. En pipette er monteret i en pipetteholder fastgjort til en treakset manipulator. Et mikroskop kamera bruges til at erhverve billeder af vævet og mikroinjektion nålen. Et brugerdefineret trykreguleringssystem bruges til at styre trykket inde i pipetten, og en programmerbar mikromanipulator bruges til at styre placeringen af mikroinjektorpipetten. Kamerabillederne af vævs- og mikroinjektionspipetten bruges til at bestemme den rumlige placering af mikroinjektionspipettespidsen og de steder, hvor mikroinjektioner skal udføres. Softwaren beregner derefter baner, der er nødvendige for at flytte pipetten i vævet. Al hardware styres af den software, vi tidligere har udviklet. Al software er skrevet i kodningssprog (f.eks https://github.com/bsbrl/Autoinjector. Den grafiske brugergrænseflade (GUI) giver brugeren mulighed for at billedet væv og mikropipette, og at tilpasse bane af mikroinjektion. Vores system kan etableres ved hjælp af relativt enkle ændringer til et omvendt mikroskop udstyret med brightfield og epi-fluorescens filtre.
Først giver vi instruktioner om forberedelse hjernen organotypiske væv skiver til mikroinjektion. Derefter illustrerer protokollen start af mikroinjektionsrobotten efterfulgt af forberedende trin, såsom pipettebevægelseskalibrering, der skal gøres før mikroinjektion. Dette efterfølges af at definere injektionsparametrene. Efter dette, brugeren kan definere bane, der anvendes af mikroinjektion robot og starte injektion procedure. Det mikroindsjævlede væv (i dette tilfælde hjerneorganotypiske vævsskiver) kan holdes i kultur i forskellige tidsperioder afhængigt af det eksperimentelle design10,11. Vævet kan behandles til at følge og studere identiteten og skæbnen for de injicerede celler og deres afkom. Alternativt kan de mikroopterede celler følges ved hjælp af levende billeddannelse. Inden for rammerne af denne protokol, viser vi brugen af robotten til automatisk mikroinjstion neurale progenitor celler i organotypic skiver af musen E14.5 dorsale telencephalon. Robotten er yderligere i stand til mikroinjektion i nyfødte neuroner i musen telencephalon, samt i den menneskelige føtale telencephalon12.
Sammenfattende beskriver vi en robotplatform, der kan bruges til at følge og manipulere enkelte celler i væv. Platformen gør brug af tryk, og det er derfor yderst alsidigt med hensyn til den kemiske karakter af forbindelsen til at injicere. Desuden kan det tilpasses til målceller andre end stamceller. Vi forventer, at vores system også let kan tilpasses andre modelsystemer.
Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærdslovgivning, og de nødvendige licenser blev indhentet fra den regionale etiske kommission for dyreforsøg i Dresden, Tyskland (Tierversuchskommission, Landesdirektion Dresden). Organotypic skiver blev fremstillet af E14.5 eller E16.5 C57BL/6 mus embryonale telencephalon (Janvier Labs).
1. Installation af software
2. Fremstilling af reagenser og pipetter
3. Fremstilling af vævssnit
4. Mikroinjektion
5. Vævskultur og vævsskiverbehandling for immunfluorescens
Microinjection tjener det formål at spore og manipulere enkelte neurale stamceller og deres afkom i levende væv og til at følge deres afstamning progression i et fysiologisk miljø. I denne artikel har vi demonstreret brugen af mikroinjektionsrobotten til målretning og automatisk mikroinjecting organotypic skiver af musetelcephalonen. Figur 2 illustrerer repræsentative billeder af vellykkede indsprøjtede progenitorceller, og figur 3 illustrerer injicerede nyfødte neuroner. Når injiceres med Dextran Alexa-488 (eller Alexa-A555) farvestof, celler synes fuldt fyldt med farvestoffet. Med hensyn til apikale stamfader (Figur 2) konfokale billeddannelse tillader rekonstruere med høj rumlig opløsning cellemorfologi, tilstedeværelsen - eller fraværet- af den apikale og basale vedhæftet fil, og at kombinere den morfologiske undersøgelse med markør udtryk. Ved at kombinere disse kriterier, kan brugeren tildele en bestemt celle skæbne til mikroindsjænges celler og deres afkom. Med hensyn til neuron injektion, brugeren kan rekonstruere neuronal morfologi, herunder struktur og funktioner i apical dendrite og axon. Automatiseret mikroinjektion kan give betydeligt højere gennemløb i forhold til manuel mikroinjektion (Figur 2B). Endvidere bekræfter EdU-mærkningen, at cellernes levedygtighed ikke påvirkes af automatisering (figur 2C). Holde organotypiske skive i kultur giver mulighed for følgende afstamning progression af de mikroopjectede celler (vi viste 4 - 24h i figur 2D). Hvis mikroinjektionsopløsningen indeholder genetisk materiale (DNA, mRNA, CRISPR-Cas9 guider) eller rekombinant proteiner, giver dette mulighed for at undersøge, om og hvordan afstamningsprogression påvirkes af manipulationen.
Mikroinjektion i enkelte neurale stamceller i væv giver fremragende enkelt celle opløsning og af den grund har det været brugt til at dissekere cellebiologi af neurale stamceller progression og skæbne overgang (Figur 3A). Microinjection tillader levering af komplekse blanding af kemikalier. Vi har tidligere gjort brug af denne funktion til at studere junctional kobling i neurale progenitor celler ved at blande gap-junctional gennemtrængelig med hul junctional uigennemtrængelig fluorescerendefarvestoffer 12. Vi udvidede tidligere arbejde ved at studere junctional kobling i nyfødte neuroner, ved at injicere Lucifer Gul sammen med Dextran-A555 (Figur 3B). Som vist i figur 3Bkobles en del af nyfødte pyramide neuroner via mellemrumskryds til tilstødende neuroner. Denne observation er i overensstemmelse med tanken om, at umodne neuroner kommunikere via gap-junction13,14. Endvidere, målretning neuroner viser, at brugen af mikroinjektion robot kan generaliseres til flere celletyper i udviklingslandene pattedyr hjernen. Denne eksperimentelle opsætning vil være nyttig til at dissekere cellebiologi af neuroner i væv, for eksempel ved at levere specifikke oligopeptider til at forstyrre protein-protein interaktioner.
Figur 1: Automatiseret opsætning og protokol for mikroinjektion. a)Samlet protokol for vævspræparat og automatiserede mikroinjektioner ved hjælp af mikroinjektionsrobotten. Højre indsat: Cartoon skematisk af mus Telencephalon målrettet til mikroinjektion i denne protokol. (B)Rutediagram over de automatiserede mikroinjektionstrin. C) Skematisk af mikroinjektion robot hardware. d) Grafisk brugergrænseflade (GUI) af den software, der bruges til at styre og betjene mikroinjektionsrobotten. Dette tal er tilpasset fra ref.12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikroinjektion af robotinjekt i apikale forfædre. Skematiske og forventede resultater ved brug af mikroinjektionsrobotten til at målrette apikale progenitorer (AP'er) via den apikale overflade (apikale injektion). (A) Øverste række. Til venstre: skematisk af processen. Til højre: GUI med relevante parametre for apical injektion. Nederste række. Til venstre: fase kontrast billede taget under injektion procedure (V: hjertekammer; BL: basal lamina). Til højre: repræsentative resultater, der viser mikroindsjævede APs. Stiplede linje repræsenterer ventrikel (V). Skalabar: 10 μm. (B) Vellykkede injektioner i minuttet for en nybegynder bruger på det manuelle mikroinjektionssystem, en erfaren bruger på det manuelle mikroinjektionssystem og mikroinjektionsrobotten. c) EdU-inkorporering i mikroindsøgte celler og i celler, der ikke injiceres, i det injicerede område. Organotypic skiver af musen E14.5 dorsal telencephalon var enten i) ikke injiceres eller (ii) udsat for manuel eller automatiseret mikroinjektion (injiceret skive) ved hjælp af Dextran-A488 (for manuel og autoinjector). Skiver blev holdt i kultur i overværelse af EdU i 24 timer, så blev de faste og farves for DAPI og EdU. Indsprøjtede og ikke-injicerede celler i det injicerede område blev scoret for EdU positivitet. (D) Brug af mikroinjektionsrobotten Lineage-sporing. Et fluorescerende farvestof (Dx3-A555, magenta) injiceres i en enkelt neuralstamcelle (t = 0 h). Fluorescerende farvestof er opdelt i datterceller (d1, d2) under mitose. Dette gør det muligt at følge afkommet af den injicerede celle (t = 4 timer og 24 timer) og afsløre afstamning progression over tid. For t = 24 h, viser vi flere eksempler på afkomet man forventer at finde. Skalastænger: 10 μm. Grafer i B og C er taget fra ref.12Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mikroinjektion af robotinjektion i neuroner. Skematiske og forventede resultater ved brug af mikroinjektionsrobotten til at målrette pyramide neuroner (N) via den basale overflade (basal injektion). (A) Øverste række. Til venstre: skematisk af processen. Til højre: GUI med relevante parametre for basal injektion. Nederste række. Til venstre: fase kontrast billede taget under injektion procedure (V: hjertekammer; BL: basal lamina). Til højre: repræsentative resultater, der viser en microinjected N. Stiplet linje repræsenterer basal lamina (BL). Skalabar: 10 μm.(B)Brug af autoinjektoren til at studere mellemrumskommunikation i væv. Pyramideale neuroner blev injiceret med en opløsning, der indeholder to farvestoffer: hullet junctional-uigennemtrængelig Dx-A555 (ikke vist) og gap-junctional gennemtrængelige Lucifer Yellow (grøn). Dx-A555 er begrænset til den målrettede celle (stjerner), mens LY spreder til celler, der er forbundet via mellemrum krydset til den målrettede celle (stiplede linjer). Venstre panel: Lav eksponering, kun de mikroopjæoperede celler er synlige. Højre panel: Høj eksponering giver mulighed for visualisering af de injicerede celler samt de koblede celler (stiplede linjer). Skalabar: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil: Fejlfinding af flere almindelige fejl, der opstår under mikroinjektion. Klik her for at downloade denne fil.
Mikroinjektion i enkelte neurale stamceller i væv giver fremragende enkelt celle opløsning og af den grund har det været brugt til at dissekere cellebiologi af neurale stamceller progression og skæbne overgang (Figur 2; seogså 10,11,12). Den automatiserede mikroinjektionsprocedure kan udføres på andre typer celler i både embryonale mus og humant hjernevæv. Repræsentative resultater af mikroinjektion af nyfødte neuroner ved at målrette telencephalonens basale overflade er vist i figur 3.
Det princip, der er etableret her, kan anvendes til at målrette mod flere forskellige celletyper i embryonale musehjerner og menneskelige hjerner. Vi har tidligere vist, at mikroinjektion robot også kan bruges til at målrette enkelt progenitor celler i musen hindhjernen og telencephalon og nyfødte neuroner i musen og menneskelige udvikle neocortex12. For at opnå de bedste resultater af injektionsproceduren bør man optimere alle trinnene, før du starter injektionen. Det er vigtigt nøje at overveje og optimere forberedelsen af levedygtige og velbevarede organotypiske vævsskiver fra hjernevæv (Figur 1). Det er afgørende at være hurtig i dissektions- og udskæringsproceduren i figur 1. For apical injektion rettet mod AP'er, bør man vælge skiver, der viser den ideelle orientering af den apikale overflade. For AP injektion, den ideelle orientering er den apikale overflade vinkelret på bunden af petriskålen. Enhver anden orientering vil være eftergivende samt, men den apikale overflade vinkelret på Petriskålen giver et bredere overfladeareal til injektion, hvilket øger succes injektion. Til injektion i neuroner, orienteringen af skiven spiller lidt at ingen effekt.
Når skiverne til injektion er valgt, injektion procedure per skive tager cirka 5 minutter. I betragtning af at man arbejder med levende væv, anbefales det stærkt at fremskynde injektionsproceduren. Til dette formål anbefaler vi at indstille alle parametre for injektion via GUI(Figur 1D),før vævet er klar, for at reducere unødvendig ventetid. Se den supplerende fil for at få foretaget fejlfinding.
I tilfælde af langsigtet skivekultur kan trin efter den automatiserede mikroinjektionsprocedure påvirke cellernes sundhed og dermed eksperimentet. Derfor anbefales det stærkt at køre en kvalitetskontroltest og optimere snitkulturforholdene. For at evaluere cellernes levedygtighed efter udskærings- og injektionsproceduren udførte vi EdU-mærkning under kulturen, og vi kvantificerede antallet af pyknotiske kerner (en proxy for apoptotiske celler) i kulturerne og injiceret væv12. Disse kvantificeringer afslørede ingen væsentlig indvirkning af mikroinfektion på vævs levedygtighed (figur 2C). Vi anbefaler at køre lignende kvalitetskontrol, samtidig med at der etableres organotypiske vævsskærings- og mikroinjektionsrørledning i laboratoriet.
Sammenlignet med manuel mikroinjektion giver mikroinjektionsrobotten flere fordele. For det første er indlæringskurven for brugeren mindre stejl i forhold til manuel injektion: en ny bruger vil nå et højt færdighedsforløb efter et begrænset antal sessioner, typisk 1 eller 2. For det andet kræver en tilsvarende færdighed i tilfælde af manuel mikroinjektion måneders træning. Injektionsproceduren er hurtigere og mere effektiv (Figur 2B). Vi kvantificerede disse parametre og fandt ud af, at mikroinjektionsrobotten overgik en dygtig manuel bruger med hensyn til injektionssucces (% af vellykket injektion/samlet antal injektioner) og i det samlede antal injektioner pr.tidsenhed 12. Dette resulterer i en samlet 300% stigning i injektionseffektiviteten (% af vellykket injektion/min.) for mikroinjektionsrobotten sammenlignet med en dygtig bruger. Stigningen i effektivitet var endnu mere udtalt, når man sammenligner mikroinjektion robot med en nybegynder bruger og nåede 700%. Sidst men ikke mindst kan mikroinfektionsrobotten nemt programmeres til systematisk at udforske alle rumlige parametre. Dette er især fordelagtigt, når mikroinjektionsrobotten tilpasses nye celler eller væv, eller når mikroinjektionsrobotten bruges til formål, der kræver forskellig rumlig opløsning.
Opbygning af mikroinjektionsrobotten kræver minimale ændringer af et eksisterende epi-fluorescensmikroskop12. Vi har tidligere givet instruktioner til denne tilpasning på https://github.com/bsbrl/Autoinjector. Når hardwaren er konfigureret, giver denne protokol vigtige metodologiske detaljer for at foretage automatiserede mikroinjektioner. Samlet set mikroinjektion robot har en vellykket injektion sats på 15,52 + 2,48 injektioner / min, hvilket er 15x større end en uerfaren bruger (1,09 ± 0,67 injektioner / min), og 3x større end en ekspert bruger (4,95 ± 1,05 injektioner / min)12. Denne forbedring i vellykket injektion sats giver både nybegyndere og ekspert brugere til at injicere flere celler i en kortere tid, som er afgørende for at bevare væv levedygtighed. Derudover kan mikroinjektionsrobotten tilpasses, og bøjningsdybden, injektionstallet, antallet af injektioner, afstanden mellem injektionerne kan alle indstilles ved hjælp af GUI'en. Disse funktioner gør det muligt at bruge mikroinjektionsrobotten som et værktøj til at optimere tidligere besværlige eksperimenter og til at udforske grundlæggende nye eksperimenter, der kræver højere udbytte end tidligere muligt.
De vigtigste begrænsninger i mikroinjektionsproceduren, vi beskrev her, er relateret til fremstilling af vævsskiver, et afgørende skridt, der kræver omfattende optimering. Desuden er mikroinjektion afhængig af tilstedeværelsen af en overflade, der kan gribes an af glaspipetten. Denne funktion begrænser den type væv og væv steder, der kan målrettes via mikroinjektion ved hjælp af den nuværende opsætning.
Mikroinjektionsrobotten bruger i øjeblikket brightfield imaging og har været anvendt i in vitro hjerne skive præparater. I fremtiden kunne mikroinjektionsrobotten kombineres med 2-fotonbilleddannelse for at øge specificiteten af enkeltcellemålretning in vivo til molekylær- eller farvestofmærkning. Der er allerede gjort en sådan indsats for encellet elektrofysiologi15,16. Den nuværende enhed kræver manuel observation af mikroinjektionsproceduren. Fremtidige versioner kan omfatte strategier for rengøring tilstoppede mikroinjection pipetter17 eller integration af væskehåndtering robotter18 for multiplexed, fuldt autonome microinjections. Disse enheder kan øge omfanget af mikroinjektion af størrelsesordener. Tilpasning af algoritmer til parallel kontrol af flere mikroinjektionspipetter19 kunne muliggøre multiplexed levering af snesevis af farvestoffer og molekylære reagenser til de samme celler i de samme eksperimenter. Dette har potentiale til at åbne nye muligheder for molekylær screening i væv.
Mikroinjektionsrobotten kan bruges til at mærke funktionelt identificerede celler ved hjælp af DNA- eller RNA-stregkoder. Dette kan igen kombineres med andre enkeltcelleanalyseteknikker, såsom enkeltcelle-RNA-sekvensering (scRNAseq) og elektronmikroskopi. Vores foreløbige resultater viser, at mikroinjected celler og deres afkom kan inddrives og isoleres ved hjælp af væv dissociation efterfulgt af FACS sortering (Taverna, ikke-offentliggjorte resultater). FACS-sorterede celler kan derefter bruges til scRNAseq. Desuden viser de foreløbige resultater, at mikroinktionrobottens enkeltcelleopløsningskapacitet kan anvendes i kombination med elektronmikroskopisk analyse til at udforske cellebiologien på neurale stamceller i væv ved høj rumlig opløsning (Taverna og Wilsch-Bräuninger, ikke-offentliggjorte resultater). Disse data tyder på, at mikroinjektionsrobotten kan bruges som et redskab til korrelativt lys og elektronmikroskopi i væv og i bredere forstand til multimodal analyse af celleidentitet og adfærd i væv.
Microinjection er afhængig af brugen af tryk, og man har råd til at injicere løsninger med høj molekylær kompleksitet (f.eks. en hel transskription). Denne funktion af mikroinjektion er blevet udnyttet i fortiden til isolering og kloning ligand-gated receptorer20. Langs denne linje kan mikroinjektionsrobotten bruges til modellering og studier af multi-genic træk på celleniveau. Kombineret med en sub-pooling strategi, mikroinjection robot kan også bruges som en platform til at identificere det mindste sæt af gener, der driver en bestemt egenskab / cellulære adfærd. Hidtil har mikroinjektionsrobotten været brugt til at manipulere cellens biokemi via levering af mRNA, DNA eller rekombinant proteiner10,21,22. Vi forudser en anvendelse af mikroinjektionsrobotten ved sondering af biofysik i det intracellulære rum, for eksempel ved at levere nanomaterialer eller nanomaskiner, der tillader sensing og/eller manipulation af de biofysiske egenskaber i det intracellulære rum.
Forfatterne har intet at afsløre.
Forfatterne vil gerne anerkende Nomis Foundation (ET). SBK anerkender midler fra maskinindustrien, College of Science and Engineering, MnDRIVE RSAM initiativ fra University of Minnesota, Minnesota institut for videregående uddannelse, National Institutes of Health (NIH) 1R21NS103098-01, 1R01NS111028, 1R34NS11654, 1R21NS112886 og 1R21 NS111196. GS blev støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship og NSF IGERT uddannelse tilskud.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Agarose, Low Melt | Carl Roth | Cat# 6351.2 | |
Agarose, Wild Range | Sigma-Aldrich | Cat# A2790 | |
Best-CA 221 Glue | Best Klebstoffe GmbH & Co.KG | Cat# CA221-10ml | |
B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17504044 | |
Cellmatrix Type-IA (Collagen, Type !) | FUJIFILM Wako Chemicals | Cat# 637-00653 | |
Distilled Water | |||
DMEM-F12, CO2 independent (w/o Phenol red) | Sigma-Aldrich | Cat# D2906 | |
DMEM-F12, CO2 independent (with Phenol red) | Sigma-Aldrich | Cat# D8900 | |
HEPES-NAOH, pH 7.2, 1M (HEPES buffer) | Carl Roth | Cat# 9105.3 | |
L-Glutamine, 200 mM | Thermo Fisher Sientific | Cat# 25030024 | |
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | Cat# 81381 | |
N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17502048 | |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 21103049 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | Cat# AM9937 | |
O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mix, 50 liters | |||
Paraformaldehyde | Merck | Cat# 818715 | |
PBS | |||
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15140122 | |
Rat serum | Charles River Laboratories | ||
Japan | |||
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | Cat# 106323 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | Cat# 106482 | |
Tyrode’s salt | Sigma | Cat# T2145-10x1L) | |
Equipment | |||
Borosilicate glass capillaries, 1.2 mm outer diameter x 0.94 mm inner diameter | Sutter Instruments | Cat# BF-120-94-10 | |
Bottle-top filter system, 500 mL | Corning | Cat# 430769 | |
Computer PC | |||
Custom pressure rig | Custom pressure rig | ||
Electronic pressure regulator | Parker Hannifin | Cat# 990-005101-002 | |
Falcon tubes, 15 mL | Corning | Cat# 430791 | |
Falcon tubes, 50 mL | Corning | Cat# 430829 | |
Fine-tip paintbrush | |||
Flaming/ Brown micropipette puller | Sutter Instruments | Cat# P-97 | |
Forceps, Dumont no. 3 | Fine Science Tools | Cat# 11231-30 | |
Forceps, Dumont no. 5 | Fine Science Tools | Cat# 11255-20 | |
Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | Cat# 11252-20 | |
Heating block | Labtech International | Cat # Dri block Digi2 | |
Inverted fluorescence microscope | Zeiss | Cat# Axiovert 200 | |
Light source | Olympus | Cat# Highlight 3100 | |
Manual pressure regulator | McMaster Carr | Cat# 0-60 PSI 41795K3 | |
Microloader Tips | Eppendorf | Cat# 5242956.003 | |
Microcontroller | Arduino | Cat# Arduino Due | |
Microscope camera Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3 | |||
Motorized stage XY for microscope | |||
Multiwell plate, 24 wells | Nunc | Cat# 142475 | |
Pasteur pipettes, plastic | |||
Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner | Cat# 628102 | |
Petri dish, 35 x 10 mm | Nunc | Cat# 153066 | |
Petri dish, 34 x 14 mm, including Microwell no. 1.5 cover glass | MatTek | Cat# P35G-1.5-14-C | |
Pipette holder | Warner Instruments | Cat# 64-2354 MP-s12u | |
Pipette and tips | |||
Puller filament, 3.0-mm square box filament | Sutter Instrument | Cat# FB330B | |
Slice culture incubation box | MPI-CBG | Cat# custom made | |
Solenoid valve | Cat# LHDA053321H-A | ||
Stereomicroscope | Olympus | Cat# SZX12 | |
Tabletop centrifuge | Heraeus | Cat# 5431622 | |
Thermometer | |||
Three-axis Manipulator | Sensapex Inc | Cat# tree-axis uMP | |
Vibratome | Leica | Cat# VT1000s | |
Whole-embryo-culture-system incubator | Ikemoto Company | Cat# RKI-10-0310 | |
Waterbath | |||
Software and Algorithms | |||
Arduino | Arduino | ||
Fiji | RRID: SCR_002285 | ||
Python | Python Software foundation | Python 2.7.12 | |
ZEN | RRID: SCR_013672 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved