JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Bioengineering

سلالة تسيطر عليها من هيدروجيلس 3D تحت التصوير المجهري لايف

Published: December 4th, 2020

DOI:

10.3791/61671

1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

تتضمن الطريقة المقدمة التمدد الأحادي من الهيدروجيلات الناعمة ثلاثية الأبعاد المضمنة في مطاط السيليكون مع السماح بالفحص المجهري البؤري الحي. يتم توضيح توصيف سلالات الهيدروجيل الخارجية والداخلية وكذلك محاذاة الألياف. الجهاز والبروتوكول وضعت يمكن تقييم استجابة الخلايا لمختلف أنظمة سلالة.

القوى الخارجية هي عامل مهم في تكوين الأنسجة، والتنمية، والصيانة. وغالبا ما تدرس آثار هذه القوى باستخدام أساليب متخصصة في تمديد المختبر. تستخدم مختلف الأنظمة المتاحة نقالات تعتمد على الركيزة ثلاثية الأبعاد ، في حين أن إمكانية الوصول إلى التقنيات ثلاثية الأبعاد لإجهاد الهيدروجيلات الناعمة ، أكثر تقييدا. هنا، ونحن نصف الطريقة التي تسمح تمتد الخارجية من الهيدروجيل لينة من محيطها، وذلك باستخدام شريط سيليكون مرنة كما الناقل عينة. تم بناء نظام التمدد المستخدمة في هذا البروتوكول من أجزاء مطبوعة ثلاثية الأبعاد وإلكترونيات منخفضة التكلفة ، مما يجعل من السهل والسهل تكرارها في مختبرات أخرى. تبدأ العملية التجريبية مع البلمرة سميكة (>100 ميكرومتر) هيدروجيلس الفيبرين لينة (معامل مرن من ~ 100 السلطة الفلسطينية) في قطع التدريجي في وسط قطاع السيليكون. ثم يتم إرفاق بنى السيليكون هلام إلى الجهاز المطبوع تمتد ووضعها على مرحلة المجهر confocal. تحت المجهر الحي يتم تنشيط جهاز التمدد ، ويتم تصوير المواد الهلامية ب مقادير مختلفة للتمدد. ثم يتم استخدام معالجة الصور لتحديد تشوهات الجل الناتجة ، مما يدل على سلالات متجانسة نسبيا ومحاذاة الألياف في جميع أنحاء سمك الجل ثلاثي الأبعاد(Z-axis). وتشمل مزايا هذه الطريقة القدرة على إجهاد الهيدروجيلات الناعمة للغاية في 3D أثناء تنفيذ المجهر في الموقع ، وحرية التلاعب في هندسة وحجم العينة وفقا لاحتياجات المستخدم. بالإضافة إلى ذلك ، مع التكيف السليم ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتمديد أنواع أخرى من الهيدروجيل (على سبيل المثال ، الكولاجين أو البولي أكريلاميد أو البولي إيثيلين غليكول) ويمكن أن تسمح بتحليل استجابة الخلايا والأنسجة للقوى الخارجية في ظل ظروف ثلاثية الأبعاد أكثر محاكاة بيولوجيا.

استجابة الأنسجة للقوى الميكانيكية هي جزء لا يتجزأ من مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني1،تمايز الخلايا2،وإعادة عرض الأنسجة3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر التغيرات الناجمة عن القوة في المصفوفة خارج الخلية (ECM) مثل محاذاة الألياف والتكثيف على سلوك الخلية وتكوين الأنسجة4و5و6. هيكل شبكة ليفية في ECM له خصائص ميكانيكية مثيرة للاهتمام، مثل مرونة غير خطية، تشوه غير affine والتشوهات البلاستيكية7،8،9....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد الحل (ليتم تنفيذه مسبقا)

  1. فيبرينوجين وضع العلامات
    ملاحظة: مطلوب خطوة وضع العلامات فقط إذا كان تحليل تشوه هلام الفيبرين هو المطلوب. للتجارب الخلوية، فمن الممكن استخدام هلام غير تسمية.
    1. إضافة 38 ميكرولتر من 10 ملغم / مل من صبغة إستر الفلورسنت (المذابة في DMSO) إلى 1.5 مل من محلول ال?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتظهر البيانات التمثيلية من امتداد ثابت من مقادير متزايدة تطبق على قطاع السيليكون تحمل هيدروجيل الفيبرين 3D، جزءا لا يتجزأ مع حبات الفلورسنت 1 ميكرومتر، في الشكل 9. يوضح التحليل تأثير امتداد السيليكون على التغيرات الهندسية للقطع وكذلك السلالات المتقدمة داخل الجل. Z-<.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تستند الطريقة والبروتوكول المعروضين هنا إلى حد كبير على دراستنا السابقة من قبل Roitblat Riba وآخرون.

وتشمل المزايا الرئيسية للطريقة المعروضة على النهج القائمة إمكانية إجهاد الهيدروجيلات ثلاثية الأبعاد الناعمة جدا (معامل مرن من ~ 100 باسكال) من محيطها ، وتحت التص.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تم تكييف بعض الأرقام المدرجة هنا بإذن من مركز إزالة حقوق الطبع والنشر: سبرينغر الطبيعة، حوليات الهندسة الطبية الحيوية. إجهاد الهيدروجيلات ثلاثية الأبعاد بسلالات موحدة من محور z مع تمكين التصوير المجهري الحي ، A. Roitblat Riba ، S. Natan ، A. Kolel ، H. Rushkin ، O. Tchaicheeyan ، A. Lesman ، حقوق الطبع والنشر © (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20002
Cell Medium (DMEM High Glucose)Biological Industries01-052-1AAdd 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5Bar-Naor Ltd.BN72204-3022×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSOSigma-Aldrich Inc.D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineBiological Industries02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human)Omrix Biopharmaceuticals3902Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen BufferN/ARecipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm)InvitrogenF8820Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone RubberMcMaster-Carr3788T41580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)GE Healthcare17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing CompoundShin-Etsu Chemical Co., Ltd.HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39National Institute of Health, Bethesda, MDVersion 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)Arduino/AdafruitArduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R CentrifugeThermo Scientific75002470
ParafilmBemisPM-996
Primovert Light MicroscopeCarl Zeiss Suzhou Co., Ltd.491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)Dassault SystèmesN/A
SCyUS Code37N/AN/A
Servomotor - TowerPro SG-5010Adafruit155
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture platesCorning430167
Thrombin bufferN/ARecipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)Biological Industries03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male)N/AN/A
Zeiss LSM 880 Confocal MicroscopeCarl Zeiss AG2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)Carl Zeiss AGRelease Version 14.0.0.0

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved