Kontrolleret stamme af 3D Hydrogels under Live Mikroskop imaging

Den præsenterede metode indebærer uniaxial strækning af 3D bløde hydrogels indlejret i silikone gummi og samtidig tillade levende confocal mikroskopi. Karakterisering af de eksterne og interne hydrogelstammer samt fiberjustering demonstreres. Den udviklede enhed og protokol kan vurdere cellernes reaktion på forskellige stammeregimer.

Eksterne kræfter er en vigtig faktor i vævsdannelse, udvikling og vedligeholdelse. Virkningerne af disse kræfter studeres ofte ved hjælp af specialiserede in vitro-stretching metoder. Forskellige tilgængelige systemer bruger 2D substrat-baserede bårer, mens tilgængeligheden af 3D-teknikker til at belaste bløde hydrogels, er mere begrænset. Her beskriver vi en metode, der tillader ekstern strækning af bløde hydrogels fra deres omkreds ved hjælp af en elastisk silikonestribe som prøvebærer. Det strækningssystem, der bruges i denne protokol, er konstrueret af 3D-printede dele og billig elektronik, hvilket gør det enkelt og nemt at replikere i andre laboratorier. Den eksperimentelle proces begynder med polymerisering tyk (> 100 μm) bløde fibrin hydrogels (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) i en udskæring i midten af en silikone strimmel. Silikone-gel konstruktioner er derefter fastgjort til den trykte-stretching enhed og placeres på confocal mikroskop fase. Under levende mikroskopi aktiveres strækkeenheden, og gelerne afbildes på forskellige strækstyrker. Billedbehandling bruges derefter til at kvantificere de resulterende gel deformationer, der viser relativt homogene stammer og fiberjustering i hele gelens 3D-tykkelse (Z-akse). Fordelene ved denne metode omfatter evnen til at belaste ekstremt bløde hydrogels i 3D, mens du udfører in situ mikroskopi, og friheden til at manipulere geometri og størrelse af prøven i henhold til brugerens behov. Derudover kan denne metode med korrekt tilpasning bruges til at strække andre typer hydrogeler (f.eks. kollagen, polyacrylamid eller polyethylenglycol) og kan give mulighed for analyse af celler og vævsrespons på eksterne kræfter under mere biomimetiske 3D-forhold.

Vævsrespons på mekaniske kræfter er en integreret del af en lang række biologiske funktioner , herunder genekspression¹, celledifferentiering²og vævsgenopbygning³. Desuden kan kraftinducerede ændringer i den ekstracellulære matrix (ECM) såsom fiberjustering og fortætning påvirke celleadfærd og vævsdannelse^4,5,6. ECM's fibernetstruktur har spændende mekaniske egenskaber, såsom ikke-lineær elasticitet, ikke-affin deformation og plastdeformationer^7,8....

1. Løsningsforberedelse (skal udføres på forhånd)

1. Fibrinogen mærkning
   BEMÆRK: Mærkningstrinnet er kun påkrævet, hvis man ønsker at analysere deformationen af fibringelen. Til cellulære eksperimenter er det muligt at bruge en umærket gel.
   1. Der tilsættes 38 μL på 10 mg/mL succinimidylester fluorescerende farvestof (opløst i DMSO) til 1,5 ml 15 mg/mL fibrinogenopløsning (molarforhold på 5:1) i et 50 ml centrifugerør og anbringes på en shaker i 1 time ved stuetemperatur. Derefter place.......

I figur 9er repræsentative data fra statiske stræk af stigende størrelsesordener anvendt på silikonestrimlen med en 3D-fibrinhydrogel, indlejret med 1 μm fluorescerende perler . Analysen viser effekten af silikone stretch på geometriske ændringer af cut-out samt de udviklede stammer i gelen. Z-stakbilleder af hele gel bruges til at evaluere deformationen af den oprindelige cirkel formet cut-out til elliptisk geometri (Figur 9A). Disse bi.......

Den metode og protokol, der præsenteres heri, er i vid udstrækning baseret på vores tidligere undersøgelse af Roitblat Riba et al.⁴¹ Vi inkluderer her det fulde computerstøttede design (CAD), Python og mikrocontrollerkoder på SCyUS-enheden.

De største fordele ved den præsenterede metode i forhold til eksisterende tilgange omfatter muligheden for at stamme meget bløde 3D hydrogels (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) fra deres omkreds, og under levende

Nogle tal, der er inkluderet her, er blevet tilpasset med tilladelse fra Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Belastende 3D hydrogels med ensartede z-aksestammer, samtidig med at der muliggøres levende mikroskopibilleddannelse, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7