Souche contrôlée d’hydrogels 3D sous imagerie par microscopie dynamique

La méthode présentée implique l’étirement uniaxial des hydrogels mous 3D incorporés dans le caoutchouc de silicone tout en permettant la microscopie confocale vivante. La caractérisation des souches externes et internes d’hydrogel ainsi que l’alignement des fibres sont démontrés. Le dispositif et le protocole développés peuvent évaluer la réponse des cellules à divers régimes de déformation.

Les forces externes sont un facteur important dans la formation, le développement, et le maintien de tissu. Les effets de ces forces sont souvent étudiés à l’aide de méthodes d’étirement in vitro spécialisées. Divers systèmes disponibles utilisent des civières 2D à base de substrat, tandis que l’accessibilité des techniques 3D pour filtrer les hydrogels mous est plus restreinte. Ici, nous décrivons une méthode qui permet l’étirement externe des hydrogels mous de leur circonférence, en utilisant une bande élastique de silicone comme support d’échantillon. Le système d’étirement utilisé dans ce protocole est construit à partir de pièces imprimées en 3D et d’électronique à faible coût, ce qui le rend simple et facile à reproduire dans d’autres laboratoires. Le processus expérimental commence par la polymérisation d’hydrogels de fibrine molle épais (>100 μm) (module élastique d’environ 100 Pa) dans une découpe au centre d’une bande de silicone. Les constructions en gel de silicone sont ensuite fixées au dispositif d’étirement imprimé et placées sur l’étage du microscope confocal. Sous microscopie en direct, le dispositif d’étirement est activé et les gels sont entifiés à différentes magnitudes d’étirement. Le traitement d’image est ensuite utilisé pour quantifier les déformations de gel résultantes, démontrant des déformations relativement homogènes et un alignement des fibres tout au long de l’épaisseur 3D du gel (axeZ). Les avantages de cette méthode incluent la possibilité de filtrer des hydrogels extrêmement mous en 3D lors de l’exécution de la microscopie in situ, et la liberté de manipuler la géométrie et la taille de l’échantillon en fonction des besoins de l’utilisateur. De plus, avec une adaptation appropriée, cette méthode peut être utilisée pour étirer d’autres types d’hydrogels (par exemple, le collagène, le polyacrylamide ou le polyéthylène glycol) et peut permettre l’analyse de la réponse des cellules et des tissus aux forces externes dans des conditions 3D plus biomimétiques.

La réponse tissulaire aux forces mécaniques fait partie intégrante d’un large éventail de fonctions biologiques, y compris l’expression^{génique 1,}la différenciation cellulaire²et le remodelage tissulaire^3. De plus, les changements induits par la force dans la matrice extracellulaire (ECM) tels que l’alignement et la densification des fibres peuvent avoir un impact sur le comportement cellulaire et la formation des tissus^4,5,6. La structure de maille fibreuse de l’ECM possède des propriétés mécaniques intri....

1. Préparation de la solution (à effectuer à l’avance)

1. Étiquetage du fibrinogène
   REMARQUE: L’étape d’étiquetage n’est requise que si l’analyse de la déformation du gel de fibrine est souhaitée. Pour les expériences cellulaires, il est possible d’utiliser un gel non étiqueté.
   1. Ajouter 38 μL de colorant fluorescent à l’ester de succinimidyle à 10 mg/mL (dissous dans du DMSO) à 1,5 mL de solution de fibrinogène à 15 mg/mL (rapport molaire de 5:1) dans un tube de centrifuga.......

Des données représentatives d’étirement statiques de magnitudes croissantes appliquées à la bande de silicone portant un hydrogel de fibrine 3D, encastré avec des billes fluorescentes de 1 μm, sont illustrées à la figure 9. L’analyse démontre l’effet de l’étirement en silicone sur les changements géométriques de la découpe ainsi que sur les souches développées dans le gel. Des images z-stack de l’ensemble du gel sont utilisées pour évaluer la dé.......

La méthode et le protocole présentés ici sont largement basés sur notre étude précédente par Roitblat Riba et al.⁴¹ Nous incluons ici les codes complets de conception assistée par ordinateur (CAO), Python et microcontrôleur du dispositif SCyUS.

Les principaux avantages de la méthode présentée par rapport aux approches existantes incluent la possibilité de forcer des hydrogels 3D très mous (module élastique de ~ 100 Pa) de leur circonférence, et .......

Certains chiffres inclus ici ont été adaptés avec la permission du Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7