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Bioengineering

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Published: December 4th, 2020

DOI:

10.3791/61671

1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.

Äußere Kräfte sind ein wichtiger Faktor bei der Bildung, Entwicklung und Erhaltung von Gewebe. Die Auswirkungen dieser Kräfte werden oft mit spezialisierten In-vitro-Dehnungsmethoden untersucht. Verschiedene verfügbare Systeme verwenden 2D-Substrat-basierte Keilrahmen, während die Zugänglichkeit von 3D-Techniken zum Belasten weicher Hydrogele eingeschränkter ist. Hier beschreiben wir eine Methode, die das äußere Dehnen von weichen Hydrogelen aus ihrem Umfang ermöglicht, wobei ein elastischer Silikonstreifen als Probenträger verwendet wird. Das in diesem Protokoll verwendete Stretching-System besteht aus 3D-gedruckten Teilen und kostengünstiger Elektronik, so dass es einfach und leicht in anderen Labors repliziert werden kann. Der experimentelle Prozess beginnt mit der Polymerisation dicker (>100 μm) weicher Fibrinhydrogele (Elastizitätsmodul von ~100 Pa) in einem Ausschnitt in der Mitte eines Silikonstreifens. Silikon-Gel-Konstrukte werden dann an der bedruckten Dehnvorrichtung befestigt und auf den konfokalen Mikroskopstand gelegt. Unter Live-Mikroskopie wird das Dehnungsgerät aktiviert und die Gele werden in verschiedenen Dehnungsgrößen abgebildet. Die Bildverarbeitung wird dann verwendet, um die resultierenden Gelverformungen zu quantifizieren und relativ homogeneDehnungen und Faserausrichtung über die gesamte 3D-Dicke des Gels (Z-Achse) zu demonstrieren. Zu den Vorteilen dieser Methode gehören die Fähigkeit, extrem weiche Hydrogele während der In-situ-Mikroskopie in 3D zu belasten, und die Freiheit, die Geometrie und Größe der Probe nach den Bedürfnissen des Benutzers zu manipulieren. Darüber hinaus kann diese Methode bei richtiger Anpassung verwendet werden, um andere Arten von Hydrogelen (z. B. Kollagen, Polyacrylamid oder Polyethylenglykol) zu dehnen und die Analyse der Reaktion von Zellen und Geweben auf äußere Kräfte unter biomimetischen 3D-Bedingungen zu ermöglichen.

Die Reaktion des Gewebes auf mechanische Kräfte ist ein integraler Bestandteil einer Vielzahl biologischer Funktionen, einschließlich Genexpression1, Zelldifferenzierung2und Gewebeumbau3. Darüber hinaus können kraftinduzierte Veränderungen in der extrazellulären Matrix (ECM) wie Faserausrichtung und Verdichtung das Zellverhalten und die Gewebebildung beeinflussen4,5,6. Die faserige Netzstruktur des ECM hat faszinierende mechanische Eigenschaften, wie nichtlineare Elastizität, nicht-affine Verformung und p....

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1. Lösungsvorbereitung (im Voraus durchzuführen)

  1. Fibrinogen-Markierung
    HINWEIS: Der Markierungsschritt ist nur erforderlich, wenn die Analyse der Verformung des Fibringels gewünscht wird. Für zelluläre Experimente ist es möglich, ein unmarkiertes Gel zu verwenden.
    1. 38 μL 10 mg/ml Succinimidylester-Fluoreszenzfarbstoff (gelöst in DMSO) zu 1,5 ml 15 mg/ml Fibrinogenlösung (Molverhältnis 5:1) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einen Shaker legen. An.......

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Repräsentative Daten von statischen Dehnungen zunehmender Größenordnungen, die auf den Silikonstreifen mit einem 3D-Fibrinhydrogel aufgebracht werden, eingebettet mit 1 μm fluoreszierenden Perlen, sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Analyse zeigt die Wirkung von Silikondehnung auf geometrische Veränderungen des Ausschnitts sowie die entwickelten Dehnungen innerhalb des Gels. Z-Stapelbilderdes gesamten Gels werden verwendet, um die Verformung des ursprünglichen kreisf.......

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Die hier vorgestellte Methode und das Protokoll basieren weitgehend auf unserer früheren Studie von Roitblat Riba et al.41 Wir schließen hier die vollständigen Computer-Aided Design (CAD), Python- und Mikrocontroller-Codes des SCyUS-Geräts ein.

Zu den wesentlichen Vorteilen der vorgestellten Methode gegenüber bestehenden Ansätzen gehört die Möglichkeit, sehr weiche 3D-Hydrogele (Elastizitätsmodul von ~100 Pa) aus ihrem Umfang und unter konfokale Li.......

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Einige hier enthaltene Figuren wurden mit Genehmigung des Copyright Clearance Center angepasst: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Straining von 3D-Hydrogelen mit gleichmäßigen Z-Achsen-Dehnungen bei gleichzeitiger Ermöglichung von Live-Mikroskopie-Bildgebung, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20002
Cell Medium (DMEM High Glucose)Biological Industries01-052-1AAdd 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5Bar-Naor Ltd.BN72204-3022×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSOSigma-Aldrich Inc.D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineBiological Industries02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human)Omrix Biopharmaceuticals3902Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen BufferN/ARecipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm)InvitrogenF8820Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone RubberMcMaster-Carr3788T41580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)GE Healthcare17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing CompoundShin-Etsu Chemical Co., Ltd.HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39National Institute of Health, Bethesda, MDVersion 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)Arduino/AdafruitArduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R CentrifugeThermo Scientific75002470
ParafilmBemisPM-996
Primovert Light MicroscopeCarl Zeiss Suzhou Co., Ltd.491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)Dassault SystèmesN/A
SCyUS Code37N/AN/A
Servomotor - TowerPro SG-5010Adafruit155
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture platesCorning430167
Thrombin bufferN/ARecipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)Biological Industries03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male)N/AN/A
Zeiss LSM 880 Confocal MicroscopeCarl Zeiss AG2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)Carl Zeiss AGRelease Version 14.0.0.0

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