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Bioengineering

लाइव माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के तहत 3डी हाइड्रोगेल का नियंत्रित तनाव

Published: December 4th, 2020

DOI:

10.3791/61671

1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

प्रस्तुत विधि में सिलिकॉन रबर में एम्बेडेड 3 डी सॉफ्ट हाइड्रोगेल का एकीय खींच शामिल है, जबकि लाइव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की अनुमति देता है। बाहरी और आंतरिक हाइड्रोगेल उपभेदों के साथ-साथ फाइबर संरेखण का लक्षण वर्णन किया जाता है। विकसित डिवाइस और प्रोटोकॉल विभिन्न तनाव व्यवस्थाओं के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का आकलन कर सकते हैं।

बाहरी ताकतें ऊतक निर्माण, विकास और रखरखाव में एक महत्वपूर्ण कारक हैं। इन ताकतों के प्रभावों का अक्सर विशेष इन विट्रो स्ट्रेचिंग विधियों का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है। विभिन्न उपलब्ध प्रणालियां 2डी सब्सट्रेट-आधारित स्ट्रेचर का उपयोग करती हैं, जबकि सॉफ्ट हाइड्रोगेल्स को तनाव देने के लिए 3डी तकनीकों की पहुंच अधिक प्रतिबंधित है। यहां, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो नमूना वाहक के रूप में लोचदार सिलिकॉन स्ट्रिप का उपयोग करके, उनकी परिधि से नरम हाइड्रोगेल के बाहरी खींच की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली स्ट्रेचिंग सिस्टम का निर्माण 3डी-मुद्रित भागों और कम लागत वाले इलेक्ट्रॉनिक्स से किया जाता है, जिससे अन्य प्रयोगशालाओं में इसे सरल और आसान बनाया जाता है। प्रायोगिक प्रक्रिया सिलिकॉन स्ट्रिप के केंद्र में कट-आउट में पॉलीमराइजिंग मोटी (>100 माइक्रोन) सॉफ्ट फिब्रिन हाइड्रोगेल्स (~ 100 पीए के लोचदार मोडुलस) के साथ शुरू होती है। सिलिकॉन-जेल निर्माण तब मुद्रित-खींच डिवाइस से जुड़े होते हैं और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चरण पर रखे जाते हैं। लाइव माइक्रोस्कोपी के तहत स्ट्रेचिंग डिवाइस सक्रिय होता है, और जैल को विभिन्न खिंचाव परिमाण पर चित्रित किया जाता है। छवि प्रसंस्करण का उपयोग तब जेल की 3 डी मोटाई(जेड-एक्सिस)में अपेक्षाकृत समरूप उपभेदों और फाइबर संरेखण का प्रदर्शन करते हुए परिणामी जेल विरूपण की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस विधि के फायदों में सीटू माइक्रोस्कोपी में निष्पादित करते समय 3 डी में बेहद नरम हाइड्रोगेल को तनाव देने की क्षमता और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार नमूने की ज्यामिति और आकार में हेरफेर करने की स्वतंत्रता शामिल है। इसके अतिरिक्त, उचित अनुकूलन के साथ, इस विधि का उपयोग अन्य प्रकार के हाइड्रोगेल (जैसे, कोलेजन, पॉलीएक्रिलीन ग्लाइकोल) को फैलाने के लिए किया जा सकता है और अधिक बायोमिमेटिक 3 डी स्थितियों के तहत बाहरी ताकतों के लिए कोशिकाओं और ऊतक प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है।

यांत्रिक बलों के ऊतक प्रतिक्रिया जीन अभिव्यक्ति1,कोशिका भेदभाव2,और ऊतक रीमॉडलिंग3सहित जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला का एक अभिन्न हिस्सा है। इसके अलावा, फाइबर संरेखण और डेन्सिफिकेशन जैसे एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में बल-प्रेरित परिवर्तन सेल व्यवहार और ऊतक निर्माण4,5,6को प्रभावित कर सकते हैं। ईसीएम की रेशेदार जाल संरचना में गैर-रैखिक लोच, गैर-एफ़िन विरूपण और प्लास्टिक विरूपण7,8,9,

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1. समाधान तैयारी (पहले से किया जाना है)

  1. फिब्रिनोजेन लेबलिंग
    नोट: लेबलिंग चरण की आवश्यकता केवल तभी होती है जब फाइब्रिन जेल के विरूपण का विश्लेषण वांछित हो। सेलुलर प्रयोगों के लिए, अवेलेबल जेल का उपयो?.......

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1 डी फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एम्बेडेड 3डी फाइब्रिन हाइड्रोगेल को ले जाने वाली सिलिकॉन स्ट्रिप पर लागू बढ़ते परिमाण के स्थिर खिंचाव से प्रतिनिधि डेटा, चित्र 9में दिखाया गया है। विश्लेष?.......

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यहां प्रस्तुत विधि और प्रोटोकॉल काफी हद तक Roitblat Riba एट अल द्वारा हमारे पिछले अध्ययन पर आधारित हैं ।४१ हम यहां पूर्ण कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन (सीएडी), पायथन और SCyUS डिवाइस के माइक्रोकंट्रो?.......

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यहां शामिल कुछ आंकड़े कॉपीराइट क्लीयरेंस सेंटर से अनुमति द्वारा अनुकूलित किए गए हैं: स्प्रिंगर नेचर, बायोमेडिकल इंजीनियरिंग के इतिहास। लाइव माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, ए रोइब्लाट रिबा, एस नाटान, ए कोलेल, एच रुशकिन, ओ त्चिचेयान, ए लेसमैन, कॉपीराइट© (2019) को सक्षम करते हुए एक समान जेड-एक्सिस उपभेदों के साथ 3डी हाइड्रोगेल्स को तनाव देते हैं।

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

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NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20002
Cell Medium (DMEM High Glucose)Biological Industries01-052-1AAdd 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5Bar-Naor Ltd.BN72204-3022×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSOSigma-Aldrich Inc.D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineBiological Industries02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human)Omrix Biopharmaceuticals3902Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen BufferN/ARecipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm)InvitrogenF8820Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone RubberMcMaster-Carr3788T41580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)GE Healthcare17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing CompoundShin-Etsu Chemical Co., Ltd.HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39National Institute of Health, Bethesda, MDVersion 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)Arduino/AdafruitArduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R CentrifugeThermo Scientific75002470
ParafilmBemisPM-996
Primovert Light MicroscopeCarl Zeiss Suzhou Co., Ltd.491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)Dassault SystèmesN/A
SCyUS Code37N/AN/A
Servomotor - TowerPro SG-5010Adafruit155
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture platesCorning430167
Thrombin bufferN/ARecipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)Biological Industries03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male)N/AN/A
Zeiss LSM 880 Confocal MicroscopeCarl Zeiss AG2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)Carl Zeiss AGRelease Version 14.0.0.0

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