Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.
외부 힘은 조직 형성, 발달 및 유지 보수에 중요한 요소입니다. 이러한 힘의 효과 종종 시험 관 스트레칭 방법을 전문 사용 하 여 공부. 다양한 사용 가능한 시스템은 2D 기판 기반 들것을 사용하는 반면, 3D 기술의 접근성은 부드러운 하이드로겔을 변형시키는 데 더 제한적입니다. 여기서는 탄성 실리콘 스트립을 샘플 캐리어로 사용하여 둘레에서 부드러운 하이드로겔의 외부 스트레칭을 허용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 활용되는 스트레칭 시스템은 3D 인쇄 부품과 저비용 전자 장치로 구성되므로 다른 실험실에서 간단하고 쉽게 복제할 수 있습니다. 실험 공정은 실리콘 스트립의 중앙에 컷아웃에서 두꺼운(>100 μm) 소프트 피브린 하이드로겔(탄성 계수 ~100Pa)을 중합하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 실리콘 겔 구조는 인쇄 된 스트레칭 장치에 부착되고 공초점 현미경 단계에 배치됩니다. 살아있는 현미경 검사에서 스트레칭 장치가 활성화되고 겔은 다양한 스트레치 크기로 이미지됩니다. 영상 처리는 젤의 3D 두께(Z-축)에 걸쳐 상대적으로 균일한 균질균및 섬유 정렬을입증하여 생성된 겔 변형을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 방법의 장점은 시투 현미경 검사법에서 실행하는 동안 3D에서 매우 부드러운 하이드로겔을 변형시키는 능력과 사용자의 요구에 따라 샘플의 형상 및 크기를 조작 할 수있는 자유를 포함한다. 또한, 적절한 적응을 통해, 이 방법은 다른 유형의 하이드로겔(예를 들어, 콜라겐, 폴리아크릴라미드 또는 폴리에틸렌 글리콜)을 스트레칭하는 데 사용될 수 있으며, 더 많은 생체 모방 3D 조건 하에서 외부 력에 대한 세포 및 조직 반응의 분석을 허용할 수 있다.
기계적 힘에 대한 조직 반응은 유전자 발현1,세포 분화2및 조직 리모델링3을포함하는 광범위한 생물학적 기능의 필수적인 부분이다. 더욱이, 섬유 정렬 및 밀도와 같은 세포외 매트릭스(ECM)의 강제 유도 된 변화는 세포 거동 및 조직형성에영향을 미칠 수 있습니다4,5,6. ECM의 섬유질 메쉬 구조는 비선형 탄성, 비미세 변형 및 플라스틱 변형7,8,9,10,11,12와같은 흥미로운 기계적 특성을 갖는다. 이러한 특성은 세포와 주변 미세 환경이 외부 기계적힘(13,14)에
1. 솔루션 준비 (사전에 수행 될)
본 원에 제시된 방법 및 프로토콜은 주로 Roitblat Riba 외.41에 의한 이전 연구를 기반으로 하며, 여기에 SCyUS 장치의 전체 컴퓨터 지원 설계(CAD), 파이썬 및 마이크로 컨트롤러 코드를 포함합니다.
기존 접근법에 비해 제시된 방법의 주요 장점은 매우 부드러운 3D 하이드로겔(+100 Pa의 탄성 계수)을 둘레에서, 그리고 살아있는 공초점 이미징하에서 변?.......
여기에 포함 된 일부 수치는 저작권 허가 센터의 허가에 의해 적응되었습니다 : 스프링어 자연, 생물 의학 공학의 연보. 라이브 현미경 이미징을 가능하게하면서 균일 한 z 축 균주를 가진 3D 하이드로겔을 긴장, A. Roitblat 리바, S. 나탄, A. 콜렐, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, 저작권© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
Servomotor - TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
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