Kontrollert stamme av 3D-hydrogeler under levende mikroskopiavbildning

Den presenterte metoden innebærer uniaxial strekking av 3D myke hydrogeler innebygd i silikongummi samtidig som levende konfokal mikroskopi tillates. Karakterisering av ytre og indre hydrogelstammer samt fiberjustering er demonstrert. Enheten og protokollen som er utviklet, kan vurdere cellenes respons på ulike strekkregimer.

Eksterne krefter er en viktig faktor i vevsdannelse, utvikling og vedlikehold. Effektene av disse kreftene studeres ofte ved hjelp av spesialiserte in vitro stretching metoder. Ulike tilgjengelige systemer bruker 2D-substratbaserte bårer, mens tilgjengeligheten av 3D-teknikker for å spenne myke hydrogeler, er mer begrenset. Her beskriver vi en metode som tillater ekstern strekking av myke hydrogeler fra omkretsen, ved hjelp av en elastisk silikonstrimmel som prøvebærer. Strekksystemet som brukes i denne protokollen er konstruert av 3D-trykte deler og rimelig elektronikk, noe som gjør det enkelt og enkelt å replikere i andre laboratorier. Den eksperimentelle prosessen begynner med å polymerisere tykke (>100 μm) myke fibrinhydrgeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) i en utskjæring i midten av en silikonstrimmel. Silikon-gelkonstruksjoner festes deretter til den trykte strekkenheten og plasseres på det konfiske mikroskopstadiet. Under levende mikroskopi aktiveres strekkenheten, og gelene er avbildet i forskjellige strekkstørrelser. Bildebehandling brukes deretter til å kvantifisere de resulterende geldeformasjonene, som demonstrerer relativt homogene stammer og fiberjustering gjennom gelens 3D-tykkelse (Z-aksen). Fordelene ved denne metoden inkluderer evnen til å spenne ekstremt myke hydrogeler i 3D mens du utfører in situ-mikroskopi, og friheten til å manipulere geometrien og størrelsen på prøven i henhold til brukerens behov. I tillegg, med riktig tilpasning, kan denne metoden brukes til å strekke andre typer hydrogeler (f.eks. kollagen, polyakrylamid eller polyetylenglykol) og kan tillate analyse av celler og vevsrespons på eksterne krefter under mer biomimetiske 3D-forhold.

Vevsrespons på mekaniske krefter er en integrert del av et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert genuttrykk¹, celledifferensiering²og vevsoppussing³. Videre kan kraftinduserte endringer i den ekstracellulære matrisen (ECM) som fiberjustering og fortetting påvirke celleadferd og vevsdannelse^4,5,6. ECM's fibrøse maskestruktur har spennende mekaniske egenskaper, for eksempel ikke-lineær elastisitet, ikke-affindeformasjon og plastdeformasjoner^7,....

1. Løsningsforberedelse (skal utføres på forhånd)

1. Fibrinogen merking
   MERK: Merketrinnet er bare nødvendig hvis det er ønskelig å analysere deformasjonen av fibringelen. For cellulære eksperimenter er det mulig å bruke en umerket gel.
   1. Tilsett 38 μL 10 mg/ml succinimidylstereorescerende fargestoff (oppløst i DMSO) til 1,5 ml 15 mg/ml fibrinogenoppløsning (molarforhold på 5:1) i et 50 ml sentrifugerør og legg på en shaker i 1 time ved romtemperatur. Deretter plasserer du røret i sentrifu.......

Representative data fra statisk strekning av økende størrelser påført silikonstripen som bærer en 3D fibrin hydrogel, innebygd med 1 μm fluorescerende perler, er vist i figur 9. Analysen viser effekten av silikonstrekk på geometriske endringer i utskjæringen samt de utviklede stammene i gelen. Z-stakkbilderav hele gelen brukes til å evaluere deformasjonen av den opprinnelige sirkelformede utskjæringen til elliptisk geometri (figur 9A).......

Metoden og protokollen som presenteres her er i stor grad basert på vår tidligere studie av Roitblat Riba et al.⁴¹ Vi inkluderer her hele dataassistert design (CAD), Python og mikrokontrollerkoder for SCyUS-enheten.

De viktigste fordelene ved den presenterte metoden over eksisterende tilnærminger inkluderer muligheten til å spenne svært myke 3D-hydrogeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) fra omkretsen, og under levende konfokal avbildning. Andre met.......

Noen figurer som er inkludert her har blitt tilpasset ved tillatelse fra Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Anstrengende 3D-hydrogeler med ensartede z-aksestammer samtidig som levende mikroskopiavbildning, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7