Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.

As forças externas são um fator importante na formação, desenvolvimento e manutenção de tecidos. Os efeitos dessas forças são frequentemente estudados usando métodos especializados de alongamento in vitro. Vários sistemas disponíveis usam macas à base de substrato 2D, enquanto a acessibilidade de técnicas 3D para coar hidrogéis macios, é mais restrita. Aqui, descrevemos um método que permite alongamento externo de hidrogéis macios a partir de sua circunferência, usando uma tira de silicone elástica como portador da amostra. O sistema de alongamento utilizado neste protocolo é construído a partir de peças impressas em 3D e eletrônicos de baixo custo, tornando-o simples e fácil de replicar em outros laboratórios. O processo experimental começa com hidrogéis de fibrina macia polimerizador (>100 μm) (Elastic Modulus de ~100 Pa) em um recorte no centro de uma tira de silicone. As construções de gel de silicone são então anexadas ao dispositivo de alongamento impresso e colocadas no estágio do microscópio confocal. Sob microscopia ao vivo, o dispositivo de alongamento é ativado, e os géis são imageados em várias magnitudes de estiramento. O processamento de imagem é então usado para quantificar as deformações de gel resultantes, demonstrando cepas relativamente homogêneas e alinhamento de fibras ao longo da espessura 3D do gel (eixoZ). As vantagens deste método incluem a capacidade de coar hidrogéis extremamente macios em 3D durante a execução da microscopia in situ, e a liberdade de manipular a geometria e o tamanho da amostra de acordo com as necessidades do usuário. Além disso, com a devida adaptação, este método pode ser usado para esticar outros tipos de hidrogéis (por exemplo, colágeno, poliacrilamida ou polietileno glicol) e pode permitir a análise de células e resposta tecidual a forças externas em condições 3D mais biomiméticas.

A resposta tecidual às forças mecânicas é parte integrante de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo expressão genética^1,diferenciação celular²e remodelação tecidual³. Além disso, alterações induzidas por força na matriz extracelular (ECM), como alinhamento de fibras e adensamento, podem impactar o comportamento celular e a formação tecidual^4,5,6. A estrutura de malha fibrosa do ECM possui propriedades mecânicas intrigantes, como elasticidade não linear, deformação não afine e deformações plástic....

1. Preparação da solução (a ser realizada com antecedência)

1. Rotulagem fibrinogênio
   NOTA: A etapa de rotulagem só é necessária se a análise da deformação do gel de fibrina for desejada. Para experimentos celulares, é possível usar um gel sem rótulo.
   1. Adicione 38 μL de 10 mg/mL de corante fluorescente de éster succinimidil (dissolvido em DMSO) a 1,5 mL de solução fibrinogênio de 15 mg/mL (razão molar de 5:1) em um tubo centrífuga de 50 mL e coloque em um agitador por 1 hora à temp.......

Dados representativos de trecho estático de magnitudes crescentes aplicadas à tira de silicone carregando um hidrogel fibrina 3D, embutido com contas fluorescentes de 1 μm, são mostrados na Figura 9. A análise demonstra o efeito do estiramento do silicone nas alterações geométricas do recorte, bem como as cepas desenvolvidas dentro do gel. Imagensde pilha de Z de todo o gel são usadas para avaliar a deformação do recorte em forma de círculo original para a geome.......

O método e o protocolo aqui apresentados são em grande parte baseados em nosso estudo anterior por Roitblat Riba et al.⁴¹ Incluímos aqui o design completo auxiliado por computador (CAD), Python e códigos microcontroladores do dispositivo SCyUS.

As principais vantagens do método apresentado sobre as abordagens existentes incluem a possibilidade de esticar hidrogéis 3D muito macios (Módulo Elástico de ~100 Pa) de sua circunferência, e sob imagens confoca.......

Algumas figuras incluídas aqui foram adaptadas por permissão do Centro de Liberação de Direitos Autorais: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Esticando hidrogéis 3D com cepas uniformes de eixo Z ao permitir imagens de microscopia ao vivo, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7