Cepa controlada de hidrogeles 3D bajo imágenes de microscopía en vivo

El método presentado implica el estiramiento uniaxial de hidrogeles blandos 3D incrustados en caucho de silicona mientras permite la microscopía confocal viva. Se demuestra la caracterización de las cepas de hidrogel externas e internas, así como la alineación de la fibra. El dispositivo y el protocolo desarrollados pueden evaluar la respuesta de las células a diversos regímenes de deformación.

Las fuerzas externas son un factor importante en la formación, el desarrollo y el mantenimiento de los tejidos. Los efectos de estas fuerzas se estudian a menudo utilizando métodos de estiramiento in vitro especializados. Varios sistemas disponibles utilizan camillas basadas en sustrato 2D, mientras que la accesibilidad de las técnicas 3D para tensar hidrogeles blandos, es más restringida. Aquí, describimos un método que permite el estiramiento externo de hidrogeles blandos de su circunferencia, utilizando una tira de silicona elástica como el portador de la muestra. El sistema de estiramiento utilizado en este protocolo está construido a partir de piezas impresas en 3D y electrónica de bajo costo, por lo que es simple y fácil de replicar en otros laboratorios. El proceso experimental comienza con hidrogeles de fibrina blanda polimerización (>100 μm) (módulo elástico de ~ 100 Pa) en un recorte en el centro de una tira de silicona. Las construcciones de gel de silicona se unen al dispositivo de estiramiento impreso y se colocan en la etapa de microscopio confocal. Bajo microscopía en vivo, se activa el dispositivo de estiramiento, y los geles se muestran en varias magnitudes de estiramiento. El procesamiento de imágenes se utiliza para cuantificar las deformaciones de gel resultantes, demostrando cepas relativamente homogéneas y alineación de fibras a lo largo del espesor 3D del gel (ejeZ). Las ventajas de este método incluyen la capacidad de colar hidrogeles extremadamente blandos en 3D mientras se ejecuta microscopía in situ, y la libertad de manipular la geometría y el tamaño de la muestra de acuerdo con las necesidades del usuario. Además, con la adaptación adecuada, este método se puede utilizar para estirar otros tipos de hidrogeles (por ejemplo, colágeno, poliacrilamida o polietilenglicol) y puede permitir el análisis de las células y la respuesta de los tejidos a las fuerzas externas en condiciones 3D más biomiméticas.

La respuesta tisular a las fuerzas mecánicas es una parte integral de una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la expresión^{génica 1,}la diferenciación celular^2,y la remodelación tisular^3. Por otra parte, los cambios inducidos por la fuerza en la matriz extracelular (ECM) tales como alineación y densificación de la fibra pueden afectar comportamiento de la célula y la formación del tejido^4,5,6. La estructura de malla fibrosa del ECM tiene propiedades mecánicas intrigantes, como elasticidad no lin....

1. Preparación de la solución (que se realizará con antelación)

1. Etiquetado de fibrinógeno
   NOTA: El paso de etiquetado es necesario sólo si se desea analizar la deformación del gel de fibrina. Para experimentos celulares, es posible usar un gel sin etiquetar.
   1. Añadir 38 μL de 10 mg/mL de colorante fluorescente de éster succinimidilo (disuelto en DMSO) a 1,5 mL de solución de fibrinógeno de 15 mg/mL (relación molar de 5:1) en un tubo de centrífuga de 50 mL y colocar en una coctelera durant.......

Los datos representativos del estiramiento estático de magnitudes crecientes aplicado a la tira de silicona portadora de un hidrogel de fibrina 3D, embebido con perlas fluorescentes de 1 μm, se muestran en la Figura 9. El análisis demuestra el efecto del estiramiento de silicona en los cambios geométricos del recorte, así como las cepas desarrolladas dentro del gel. Lasimágenes de pila Z de todo el gel se utilizan para evaluar la deformación del recorte original en f.......

El método y el protocolo presentados aquí se basan en gran medida en nuestro estudio anterior de Roitblat Riba et al.⁴¹ Incluimos aquí el diseño completo asistido por computadora (CAD), Python y los códigos de microcontrolador del dispositivo SCyUS.

Las principales ventajas del método presentado sobre los enfoques existentes incluyen la posibilidad de colar hidrogeles 3D muy suaves (módulo elástico de ~ 100 Pa) desde su circunferencia, y bajo imágenes .......

Algunas figuras incluidas aquí han sido adaptadas con permiso del Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7