Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Den presenterade metoden innebär enaxial sträckning av 3D mjuka hydrogeler inbäddade i silikongummi samtidigt som levande konfokal mikroskopi tillåts. Karakterisering av de yttre och inre hydrogelstammarna samt fiberjustering demonstreras. Enheten och protokollet som utvecklats kan bedöma cellernas reaktion på olika stamregimer.
Yttre krafter är en viktig faktor i vävnadsbildning, utveckling och underhåll. Effekterna av dessa krafter studeras ofta med hjälp av specialiserade in vitro-stretchingmetoder. Olika tillgängliga system använder 2D-substratbaserade bårar, medan tillgängligheten till 3D-tekniker för att spänna mjuka hydrogeler är mer begränsad. Här beskriver vi en metod som möjliggör extern sträckning av mjuka hydrogeler från deras omkrets, med hjälp av en elastisk silikonremsa som provbärare. Stretchsystemet som används i detta protokoll är konstruerat av 3D-printade delar och billig elektronik, vilket gör det enkelt och enkelt att replikera i andra labb. Den experimentella processen börjar med polymerisering av tjocka (>100 μm) mjuka fibrinhydrogeler (Elastisk Modulus på ~ 100 Pa) i en utskärning i mitten av en silikonremsa. Silikongelkonstruktioner fästs sedan på den tryckta sträckningsanordningen och placeras på det konfokala mikroskopstadiet. Under levande mikroskopi aktiveras sträckanordningen och gelerna avbildas med olika stretchstorlekar. Bildbehandling används sedan för att kvantifiera de resulterande geldeformationerna, vilket visar relativt homogena stammar och fiberjustering genom hela geléns 3D-tjocklek(Z-axel). Fördelarna med denna metod inkluderar förmågan att spänna extremt mjuka hydrogeler i 3D medan du utför in situ-mikroskopi och friheten att manipulera provets geometri och storlek enligt användarens behov. Dessutom, med korrekt anpassning, denna metod kan användas för att sträcka andra typer av hydrogeler (t.ex. kollagen, polyakrylamid eller polyetylenglykol) och kan möjliggöra analys av celler och vävnadsrespons på yttre krafter under mer biomimetiska 3D-förhållanden.
Vävnadsrespons på mekaniska krafter är en integrerad del av ett brett spektrum av biologiska funktioner, inklusivegenuttryck 1, cell differentiering2, och vävnadsrenovering3. Dessutom kan kraftinducerade förändringar i den extracellulära matrisen (ECM) såsom fiberjustering och förtätning påverka cellbeteende och vävnadsbildning4,5,6. ECM: s fibrösa nätstruktur har spännande mekaniska egenskaper, såsom icke-linjär elasticitet, icke-affindeformation och plastdeformationer7,
1. Lösningsberedning (ska utföras i förväg)
Representativa data från statisk sträcka av ökande magnitud som appliceras på silikonremsan med en 3D-fibrinhydrogel, inbäddad med 1 μm fluorescerande pärlor, visas i figur 9. Analysen visar effekten av silikonsträcka på geometriska förändringar av utskärningen samt de utvecklade stammarna i gelén. Z-stackbilder av hela gelén används för att utvärdera deformationen av den ursprungliga cirkelformade utskärningen till den elliptiska geometrin (
Metoden och protokollet som presenteras häri är till stor del baserade på vår tidigare studie av Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderar här den fullständiga datorstödda designen (CAD), Python och mikrokontrollerkoderna för SCyUS-enheten.
De stora fördelarna med den presenterade metoden jämfört med befintliga metoder inkluderar möjligheten att spänna mycket mjuka 3D-hydrogeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) från deras omkrets och under levande
Några siffror som ingår här har anpassats med tillstånd från Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019) sila 3D-hydrogeler med enhetliga z-axelstammar samtidigt som de möjliggör levande mikroskopiavbildning.
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
Servomotor - TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved