JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Bioengineering

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

Published: December 4th, 2020

DOI:

10.3791/61671

1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

Sunulan yöntem, canlı konfokal mikroskopiye izin verirken silikon kauçuğun içine gömülü 3D yumuşak hidrojellerin tek eksenli gerilmesini içerir. Dış ve iç hidrojel suşlarının karakterizasyonu ve fiber hizalaması gösterilmiştir. Geliştirilen cihaz ve protokol, hücrelerin çeşitli gerinim rejimlerine tepkisini değerlendirebilir.

Dış kuvvetler doku oluşumunda, gelişiminde ve bakımında önemli bir faktördür. Bu kuvvetlerin etkileri genellikle özel in vitro germe yöntemleri kullanılarak incelenir. Mevcut çeşitli sistemler 2D substrat bazlı sedyeler kullanırken, yumuşak hidrojelleri zorlamak için 3D tekniklerin erişilebilirliği daha kısıtlıdır. Burada, yumuşak hidrojellerin çevrelerinden dış gerilmesine izin veren bir yöntemi, numune taşıyıcı olarak elastik bir silikon şerit kullanarak açıklıyoruz. Bu protokolde kullanılan germe sistemi, 3D baskılı parçalardan ve düşük maliyetli elektronikten inşa edilmiştir, bu da diğer laboratuvarlarda çoğaltılmasını basit ve kolay hale getirir. Deneysel süreç, silikon şeridin ortasındaki bir kesmede kalın (>100 μm) yumuşak fibrin hidrojelleri (~100 Pa'nın Elastik Modülü) polimerizasyonu ile başlar. Silikon jel yapılar daha sonra baskılı germe cihazına tutturulur ve konfokal mikroskop aşamasına yerleştirilir. Canlı mikroskopi altında germe cihazı etkinleştirilir ve jeller çeşitli streç büyüklüklerinde görüntülenir. Görüntü işleme daha sonra elde edilen jel deformasyonlarını ölçmek için kullanılır ve jelin 3D kalınlığı(Zekseni) boyunca nispeten homojen suşları ve lif hizalamasını gösterir. Bu yöntemin avantajları arasında in situ mikroskopiyi yürütürken son derece yumuşak hidrojelleri 3D olarak germe yeteneği ve numunenin geometrisini ve boyutunu kullanıcının ihtiyaçlarına göre manipüle etme özgürlüğü yer almaktadır. Ek olarak, uygun adaptasyon ile bu yöntem diğer hidrojel türlerini (örneğin kollajen, poliakrilamid veya polietilen glikol) germek için kullanılabilir ve daha biyomimetik 3D koşullar altında dış kuvvetlere hücrelerin ve doku tepkisinin analizine izin verebilir.

Mekanik kuvvetlere doku tepkisi, gen ekspresyasyonu1,hücre farklılaşması2ve doku tadilatı3dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik fonksiyonların ayrılmaz bir parçasıdır. Ayrıca, lif hizalama ve densifikasyon gibi hücre dışı matriste (ECM) kuvvet kaynaklı değişiklikler hücre davranışını ve doku oluşumunu etkileyebilir4,5,6. ECM'nin lifli ağ yapısı, doğrusal olmayan elastikiyet, afin dışı deformasyon ve plastik deformasyonlar 7 , 8 , 9,10,

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Çözelti hazırlama (önceden yapılacaktır)

  1. Fibrinojen etiketleme
    NOT: Etiketleme adımı sadece fibrin jelinin deformasyonunu analiz etmek isteniyorsa gereklidir. Hücresel deneyler için etiketsiz bir jel kullanmak mümkündür.
    1. 50 mL santrifüj tüpüne 15 mg/mL fibrinojen çözeltisinin (molar oranı 5:1) 1,5 mL'ye 10 mg/mL süksinidil ester floresan boyasının (DMSO'da çözünür) 38 μL'yi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra, tüp.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1 μm floresan boncuk ile gömülü 3D fibrin hidrojel taşıyan silikon şeride uygulanan artan büyüklüklerin statik streçlerinden elde edilen temsili veriler Şekil 9'dagösterilmiştir. Analiz, silikon streçlerin, jel içindeki gelişmiş suşların yanı sıra kesmenin geometrik değişiklikleri üzerindeki etkisini göstermektedir. Tüm jelin Z-yığıngörüntüleri, eliptik geometriye kesilmiş orijinal dairenin deformasyonunu değerlendirmek için kullanılır .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada sunulan yöntem ve protokol büyük ölçüde Roitblat Riba ve ark.41 tarafından yapılan önceki çalışmamıza dayanmaktadır.

Sunulan yöntemin mevcut yaklaşımlara göre en büyük avantajları arasında çok yumuşak 3D hidrojellerin (~100 Pa'nın Elastik Modülü) çevrelerinden ve canlı konfokal görüntüleme altında zorlanma olasılığı yer almaktadır. Diğer yöntemler genellikle Zekseninde gerinim alanları uygulama .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada yer alan bazı rakamlar Telif Hakkı Temizleme Merkezi'nden izin alarak uyarlanmıştır: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Canlı mikroskopi görüntülemeyi mümkün kılarken 3D hidrojelleri tek tip z ekseni suşlarıyla germe, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Telif Hakkı© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20002
Cell Medium (DMEM High Glucose)Biological Industries01-052-1AAdd 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5Bar-Naor Ltd.BN72204-3022×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSOSigma-Aldrich Inc.D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineBiological Industries02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human)Omrix Biopharmaceuticals3902Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen BufferN/ARecipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm)InvitrogenF8820Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone RubberMcMaster-Carr3788T41580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)GE Healthcare17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing CompoundShin-Etsu Chemical Co., Ltd.HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39National Institute of Health, Bethesda, MDVersion 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)Arduino/AdafruitArduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R CentrifugeThermo Scientific75002470
ParafilmBemisPM-996
Primovert Light MicroscopeCarl Zeiss Suzhou Co., Ltd.491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)Dassault SystèmesN/A
SCyUS Code37N/AN/A
Servomotor - TowerPro SG-5010Adafruit155
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture platesCorning430167
Thrombin bufferN/ARecipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)Biological Industries03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male)N/AN/A
Zeiss LSM 880 Confocal MicroscopeCarl Zeiss AG2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)Carl Zeiss AGRelease Version 14.0.0.0

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved